防風愈傷組織超低溫保存及其玻璃化現(xiàn)象研究.pdf

1、以防風(Saposhnikovia divaricata(Turcz.) Schischk.)為材料，建立了組織培養(yǎng)再生體系，對防風試管苗玻璃化現(xiàn)象進行了研究。為避免連續(xù)繼代造成的愈傷組織變異，探索新的種質資源保存方法，對防風愈傷組織進行了超低溫冷凍保存及植株再生研究。以3周齡的愈傷組織為材料，單一變量法研究適宜的玻璃化法超低溫保存程序。結果表明，
　　1.莖段是誘導愈傷組織的最佳外植體，最佳誘導培養(yǎng)基為MS+1.5 mg·L-1

2、2，4-D+0.5mg·L-1 KT+1.0 mg·L-16-BA。MS培養(yǎng)基中附加1.0 mg·L-16-BA和1.0 mg·L-1 NAA時，愈傷組織質地緊密，呈黃綠色，后期出芽率較高，最適合防風愈傷組織的繼代培養(yǎng)。
　　2.MS+1.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA為誘導不定芽的最佳培養(yǎng)基。最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0.5 mg·L-1+6-BA0.2 mg·L-1。試管苗在腐殖土∶蛭石∶河沙(1

3、∶1∶1)的基質中移栽成活率最高，達92％，是最理想的移栽基質。
　　3.與正常試管苗相比，玻璃化苗形態(tài)異常，防風玻璃苗的組織含水量比正常苗增加了6.64％;葉綠素a、葉綠素b及葉綠素總量出現(xiàn)顯著下降，較正常苗分別降低了62.88％、59.74％和63.98％，可溶性蛋白含量降低，過氧化物酶活性升高。
　　4.正常苗和玻璃苗的過氧化物酶同工酶譜存在明顯的差別，正常苗有5條帶，其Rf值分別為0.150、0.179、0.300、

4、0.372、0.688;玻璃苗與正常苗相比有較多次生帶，其中Rf值在0.300和0.372的兩條酸性區(qū)帶明顯減弱。
　　5.培養(yǎng)基內6-BA濃度大于2.0 mg·L-1、光照強度低于2000lx、培養(yǎng)瓶內濕度大都極易導致防風試管苗的玻璃化，減少愈傷繼代次數(shù)，增加培養(yǎng)基內瓊脂和蔗糖濃度，可以降低玻璃化率。
　　6.通過改變培養(yǎng)環(huán)境可以使輕中度的玻璃化苗恢復正常。優(yōu)化的再生培養(yǎng)體系為:嫩莖段做外植體，繼代3次左右的愈傷組織用于分

5、化出芽，芽繼代增殖時，6-BA濃度在1.0 mg·L-1和0.5 mg·L-1間交替使用，培養(yǎng)光照3000～40001x。
　　7.超低溫保存的最佳方案為:4℃條件下于MS+1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA+5％DMSO的繼代培養(yǎng)基中預培養(yǎng)3d，60％PVS2常溫裝載20min,2℃100％PVS2脫水45min后直接投入液氮;1.0mol·L-1蔗糖的MS溶液洗滌、暗培養(yǎng)14d以上有助于凍后愈傷組織恢復生