香蕉種質(zhì)超低溫保存研究.pdf

1、香蕉(Musa spp．)是大型的多年生草本果樹(shù)，為熱帶亞熱帶發(fā)展中國(guó)家4億多人提供了基本的食物來(lái)源。由于香蕉主要栽培品種多為三倍體，為營(yíng)養(yǎng)性結(jié)實(shí)，所以其種質(zhì)資源無(wú)法通過(guò)低溫庫(kù)進(jìn)行種子保存。田間保存需要占用大片土地和消耗大量的人力物力，且易受到病蟲(chóng)害的侵襲。試管苗保存需要經(jīng)常繼代，易污染和發(fā)生體細(xì)胞變異。所以超低溫保存是目前長(zhǎng)期而穩(wěn)定保存其種質(zhì)的較好方法。本研究以香蕉離體莖尖為保存材料，對(duì)小滴玻璃化法超低溫保存的影響因素進(jìn)行了研究，并比

2、較了小滴玻璃化法和玻璃化法超低溫保存的效果，初步建立了適于香蕉種質(zhì)超低溫保存的技術(shù)方法，并對(duì)超低溫保存后的再生植株進(jìn)行了遺傳穩(wěn)定性的鑒定。主要研究結(jié)果如下： 1．通過(guò)對(duì)莖尖葉原基數(shù)目、預(yù)培養(yǎng)、裝載時(shí)間、PVS2處理時(shí)間、PVS種類(lèi)等幾個(gè)影響超低溫保存的因素進(jìn)行單因子試驗(yàn)，確定了每個(gè)因素的最佳處理，從而建立了小滴玻璃化法超低溫保存的優(yōu)化體系：選擇在含60g/L蔗糖的生根培養(yǎng)基上繼代1～2個(gè)月的粗壯試管苗，剝?nèi)『?～2片葉原基的莖

3、尖，在室溫下用MS+2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖溶液黑暗裝載一段時(shí)間(30min～4h)，，再在0℃下PVS2處理40～50min，接著將莖尖轉(zhuǎn)移至鋁箔上的PVS2小滴上，迅速裝入盛滿(mǎn)液氮的冷凍管中，然后投入液氮中保存。保存1h后，將鋁箔取出投入MS+1.2mol/L蔗糖卸載液中快速解凍，幾秒鐘后將化凍的莖尖轉(zhuǎn)入新的卸載液中洗滌15min，然后轉(zhuǎn)入MS+0.3mol/L蔗糖的半固體培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2d，再轉(zhuǎn)到MS+0.5mg/L

4、 BA的恢復(fù)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)1周，之后轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)。 2．采用小滴玻璃化法和玻璃化法兩種方法保存5個(gè)香蕉品種(碧盛、巴西、東大、海貢、抗枯1號(hào))。試驗(yàn)結(jié)果表明：5個(gè)品種用小滴玻璃化法保存后再生率都高于玻璃化法，平均高25.7％。其中碧盛、東大兩個(gè)品種用兩種方法保存后的結(jié)果差異顯著。所以，小滴玻璃化法更適用于香蕉超低溫保存。 3．用優(yōu)化的超低溫保存體系保存了屬于6個(gè)基因組型的14個(gè)香蕉品種，每種基因組型的平均再生率為：ABB

5、49.5％，AAA49.1％，AAAB37.7％，AA38.3％，ABBB51.9％，AAB48.2％。結(jié)果表明，各基因組型的凍后再生率沒(méi)有顯著差異，不同B基因組數(shù)目的品種間再生率也沒(méi)有顯著差異。 4．從形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)(SSR)兩個(gè)方面對(duì)保存后的香蕉再生植株進(jìn)行了遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)。結(jié)果表明：在形態(tài)上，再生植株的葉片大小、葉片顏色、葉片形狀以及增殖與生根都和保存前植株沒(méi)有顯著差異；分別用21對(duì)和19對(duì)SSR引物對(duì)碧盛，巴西兩個(gè)品