LEC1對(duì)棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生的影響.pdf

1、目的：棉花在紡織加工和油料生產(chǎn)等方面具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前，通過基因工程進(jìn)行分子水平育種是棉花種質(zhì)創(chuàng)新的熱點(diǎn)，然而，大多數(shù)棉花體胚發(fā)生系統(tǒng)都存在體胚發(fā)生率低、萌發(fā)率低、畸形率高、植株再生率低等問題，且對(duì)基因型的依賴性極強(qiáng)。體胚發(fā)生和植株再生成為棉花轉(zhuǎn)基因工程的主要技術(shù)“瓶頸”。LEC1基因是規(guī)范子葉特性和完成胚胎發(fā)育成熟所必需的調(diào)控因子，可通過激活發(fā)育早期參與胚胎形態(tài)建成和細(xì)胞分化等胚胎特異性基因的表達(dá)而誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎的形成。農(nóng)桿菌介

2、導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)會(huì)誘發(fā)棉花固有的防御反應(yīng)，造成其遺傳轉(zhuǎn)化率低下。在單子葉植物黑麥草中發(fā)現(xiàn)，無肌醇、谷氨酰胺及冷休克的聯(lián)合優(yōu)化處理可以降低其自身防御反應(yīng)，從而提高其遺傳轉(zhuǎn)化率。因此，本研究一方面通過 LEC1基因在棉花中的遺傳轉(zhuǎn)化及體胚發(fā)生再生出轉(zhuǎn)基因植株，并希望在后期探究該基因?qū)γ藁w細(xì)胞胚胎發(fā)生的影響。另一方面，研究無肌醇、谷氨酰胺及冷休克的聯(lián)合處理對(duì)棉花下胚軸防御反應(yīng)及遺傳轉(zhuǎn)化率的影響。旨在通過基因工程手段對(duì)棉花種質(zhì)創(chuàng)新和品種改良提供理

3、論指導(dǎo)。
　　方法：本研究利用含棉花LEC1基因（GbLEC1A, GbLEC1B）和大葉落地生根B域短缺LEC1基因(KdLEC1)的地塞米松（DEX）誘導(dǎo)型表達(dá)載體pIGbLEC1A,pIGbLEC1B,pIKdLEC1，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)KdLEC1在棉花新海15號(hào)下胚軸以及GbLEC1A,GbLEC1B, KdLEC1在棉花新陸早33號(hào)胚性愈傷組織中的遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)潮霉素篩選，體胚發(fā)生過程，對(duì)分化的KdLEC1轉(zhuǎn)基因新海15號(hào)胚

4、性愈傷組織系和再生植株以及GbLEC1A, GbLEC1B, KdLEC1轉(zhuǎn)基因新陸早33號(hào)再生植株進(jìn)行PCR鑒定。以轉(zhuǎn)基因成功的3個(gè)KdLEC1轉(zhuǎn)基因新海15號(hào)胚性愈傷組織系為試材，分別進(jìn)行30uM DEX和無DEX的6h懸浮誘導(dǎo)處理，實(shí)時(shí)定量PCR分析不同處理?xiàng)l件下KdLEC1轉(zhuǎn)基因胚性愈傷組織系中目的基因的相對(duì)表達(dá)量。通過高效熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR（hi TAIL PCR）、測(cè)序及Blast序列比對(duì)分析KdLEC1-4轉(zhuǎn)基因新海15號(hào)

5、再生植株基因組中的T-DNA插入位點(diǎn)。并希望后期以LEC1轉(zhuǎn)基因植株的F1代為材料，探究LEC1基因?qū)γ藁ㄅ咝赞D(zhuǎn)變、體胚發(fā)生及植株再生的影響。此外，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)pCAMBIA1301表達(dá)載體侵染前和遺傳轉(zhuǎn)化過程中，通過肌醇、谷氨酰胺和冷休克不同組合方式處理新陸早33號(hào)下胚軸，經(jīng)pCAMBIA1301遺傳轉(zhuǎn)化及共培養(yǎng)后的DAB染色和GUS染色，研究該處理對(duì)棉花防御反應(yīng)及其遺傳轉(zhuǎn)化率的影響。
　　結(jié)果與結(jié)論：（1）經(jīng)為期13個(gè)月的體胚

6、發(fā)生過程和PCR鑒定，獲得了兩棵獨(dú)立轉(zhuǎn)化的KdLEC1轉(zhuǎn)基因新海15號(hào)再生植株；分別獲得了一棵PCR鑒定正確的GbLEC1A,GbLEC1B, KdLEC1轉(zhuǎn)基因新陸早33號(hào)植株，其再生周期約為10個(gè)月。實(shí)時(shí)定量PCR分析顯示，3個(gè)KdLEC1轉(zhuǎn)基因胚性愈傷組織系中，KdLEC1的相對(duì)表達(dá)量在2.5倍和23倍之間波動(dòng)，表明該DEX誘導(dǎo)型表達(dá)載體pINDEX3可以在不同水平誘導(dǎo)KdLEC1的表達(dá)。Hi TAIL PCR及Blast序列比對(duì)