玉米黑粉菌CYP51基因表達及定點突變研究.pdf

1、玉米黑粉病是影響玉米產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病害，廣泛發(fā)生在世界各玉米產(chǎn)區(qū)。每年玉米黑粉病的爆發(fā)給農(nóng)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。甾醇14α-去甲基化酶（CYP51）是唯一發(fā)現(xiàn)普遍存在于所有生物的細胞色素P450家族的一個蛋白質(zhì)的成員。它是麥角甾醇生物合成過程中的一個關(guān)鍵酶。該酶的缺乏將導(dǎo)致細胞膜的結(jié)構(gòu)破壞和功能的喪失，最終導(dǎo)致真菌死亡。DMIs類殺菌劑是目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中主要使用的一類抗真菌劑，它通過抑制真菌CYP51而發(fā)揮殺菌抑菌的作用。本研究以玉米黑

2、粉菌（Ustilago maydis）為研究對象，結(jié)合分子克隆技術(shù)和定點突變技術(shù)，從兩方面研究了重組玉米黑粉菌CYP51的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。研究結(jié)果如下： 1.重組玉米黑粉菌CYP51的高效表達。研究表明，去除N端跨膜區(qū)對YHCYP51表達至關(guān)重要。不管采用哪種載體（pET-28a、pET-32a及pGEX-KG）和宿主菌（BL21（DE3）、BL21（DE3）pLysS及Rosetta（DE3）），全長YHCYP51在E.co

3、li中均不表達。通過生物信息學(xué)手段分析CYP51基因結(jié)構(gòu)，重新設(shè)計兩對分別去除編碼N端的不同跨膜區(qū)氨基酸殘基的CYP51引物（分別去除20和35個氨基酸）。改造了原有的未能表達的重組質(zhì)粒pET28-YH，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28-YH-20和pET28-YH-35，同時更換兩種載體構(gòu)建了另外四種不同的重組表達質(zhì)粒。選用不同宿主菌誘導(dǎo)表達六種重組質(zhì)粒并進行表達條件的優(yōu)化。SDS-PAGE分析結(jié)果表明：僅有pET32-YH-35能夠在E.c

4、oli BL21（DE3）中高效表達（30℃，0.5mmol／LIPTG誘導(dǎo)），且能夠保持CO結(jié)合活性。通過與戊唑醇等四種商品化殺菌劑和25種XF（16種）及ZST（9種）系列合成殺菌劑的結(jié)合光譜和結(jié)合常數(shù)，分析表明：XF-113和ZST-4兩種化合物的結(jié)合常數(shù)接近商品化殺菌劑，有可能開發(fā)成為新的殺真菌劑。高效表達的重組YHCYP51蛋白在變性條件下經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化，SDS-PAGE分析表明，純化的目的蛋白為單一譜帶。同時構(gòu)

5、建了真核表達質(zhì)粒pAUR123-YH，采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化后篩選陽性轉(zhuǎn)化子進行真核表達，SDS-PAGE電泳表明在66kD處出現(xiàn)特異表達條帶。 2.重組玉米黑粉菌CYP51活性部位的結(jié)構(gòu)與功能分析。由于蛋白的活性中心氨基酸殘基能夠影響其與藥物的相互作用，分析玉米黑粉菌與多種真菌及結(jié)核分枝桿菌CYP51序列的同源性和保守性，選擇可能參與殺菌劑結(jié)合的殘基進行突變。本實驗選擇了所有生物CYP51中高度保守的Tyr95和His293及真菌中保