重組柑桔綠霉菌CYP51及其突變體與殺真菌劑結(jié)合光譜測(cè)定分析.pdf

1、柑桔綠霉菌是引起柑桔病害的重要病原真菌之一，可引發(fā)柑桔綠霉病，導(dǎo)致柑桔大量腐爛，給生產(chǎn)和生活造成巨大損失。烯唑醇和三唑酮是兩種最為典型的三唑類(lèi)殺真菌劑。它們具有很多優(yōu)點(diǎn)，比如同時(shí)具有保護(hù)和防治的效果、只需使用很少的劑量就可以起到較長(zhǎng)時(shí)期的防治效果等。正是由于它們的優(yōu)點(diǎn)較為明顯，烯唑醇和三唑酮被廣泛的使用在柑桔貯藏期病害防治中。烯唑醇和三唑酮都是14α-脫甲基酶抑制劑即DMIs。它們的作用原理是通過(guò)作用于CYP51，使細(xì)胞膜的組成成分麥角

2、甾醇合成受阻，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，最終達(dá)到抑制真菌的生長(zhǎng)和殺死真菌的目的。雖然三唑類(lèi)殺真菌劑的優(yōu)點(diǎn)非常突出，但是由于長(zhǎng)時(shí)間和大范圍的使用，它也逐漸暴露出很多問(wèn)題。它的作用位點(diǎn)較為專(zhuān)一，長(zhǎng)時(shí)間的使用使得抗藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重。近幾年環(huán)境問(wèn)題日趨嚴(yán)重，農(nóng)業(yè)中的真菌病害發(fā)病率也迅速增加。2008年我國(guó)四川省就發(fā)生了大范圍的柑桔病害，還波及到了周?chē)氖》?。人們不斷的使用DMIs，但是效果卻越來(lái)越有限主要原因就是抗藥菌株的大量出現(xiàn)。面對(duì)這種現(xiàn)狀，迫切需

3、要開(kāi)發(fā)新一代的高效、低毒、專(zhuān)一性強(qiáng)的殺真菌劑。 在以往的研究中，殺真菌劑的開(kāi)發(fā)主要通過(guò)對(duì)已有殺真菌劑的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造和修飾，這種方法往往具有隨機(jī)性和盲目性。合成大量的化合物進(jìn)行生物篩選，不但增加了工作量，也浪費(fèi)了很多研究資源，不符合今后科研的總方向。人們一直在努力尋找更加省時(shí)省力的研究思路。 本文研究了三類(lèi)新型含氮化合物的離體抑菌活性及與異源表達(dá)的重組CYP51的結(jié)合能力。并根據(jù)生物信息學(xué)及分子對(duì)接結(jié)果，構(gòu)建了不同的CYP

4、51突變體。分析其與殺真菌劑的結(jié)合能力，進(jìn)一步探討其構(gòu)效關(guān)系。研究結(jié)果如下： 1.以原核表達(dá)的重組柑桔綠霉菌CYP51為材料，分析了其與商品化DMIs殺真菌劑烯唑醇、三唑酮及四種Q系列化合物的結(jié)合能力，并測(cè)定了這些化合物的離體抑菌活性。殺真菌劑通過(guò)與蛋白作用抑制真菌生長(zhǎng)，其與蛋白的結(jié)合能力能夠在一定程度上反映其抑菌能力，所以采用離體抑菌活性測(cè)定與結(jié)合光譜相結(jié)合的方法結(jié)果更加準(zhǔn)確。應(yīng)用結(jié)合光譜法對(duì)C系列、Z系列和Q系列化合物進(jìn)行了

5、結(jié)合光譜測(cè)定，結(jié)合生物測(cè)定結(jié)果，篩選出了一批兼具結(jié)合能力強(qiáng)和殺菌效果好的化合物。分別為C系列中的C-3、C-5和C-12；Z系列中的Z-5；Q系列中Q-6、Q-9和Q-10。尤其是Q-6、Q-9和Q-10與已商品化的三唑酮比較，其效果相當(dāng)或更好，更具開(kāi)發(fā)潛力。 2.根據(jù)生物信息學(xué)分析及分子對(duì)接結(jié)果，構(gòu)建了兩種CYP51突變體，即去掉跨膜區(qū)及及僅含活性中心的突變體，分別實(shí)現(xiàn)了它們?cè)诖竽c桿菌和畢赤酵母中的表達(dá)。分析柑桔綠霉菌CYP5