糖多孢紅霉菌λC3-SRR突變體構(gòu)建及其產(chǎn)物鑒定.pdf

1、　　本文利用染色體同源重組方法，將糖多孢紅霉菌染色體上KR6酶域DNA序列中編碼VSRRG中的SRR三個(gè)氨基酸的九個(gè)核苷酸敲除，獲得了可合成酮內(nèi)酯類3-脫氧-3-羰基-紅霉內(nèi)酯B的糖多孢紅霉菌突變體λC3-SRR，為下一步篩選有生物活性的酮內(nèi)酯類抗生素奠定了基礎(chǔ)。以糖多孢紅霉菌基因組DNA為模板，用重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增出敲除了SRR三個(gè)氨基酸相應(yīng)九核苷酸序列的KR6酶域DNA片段，并克隆到同源重組載體pWHM3上，構(gòu)建了質(zhì)粒pWHM3-S

2、RR。ZabspecFab質(zhì)譜分析，證實(shí)菌株λC3-SRR合成了酮內(nèi)酯類化合物3-脫氧-3-羰基-紅霉內(nèi)酯B(DOEB)，至此我們通過(guò)定點(diǎn)突變的方法，利用染色體同源重組技術(shù)，獲得了可合成酮內(nèi)酯類3-脫氧-3-羰基-紅霉內(nèi)酯B的糖多孢紅霉菌突變體λC3-SRR。比較糖多孢紅霉菌突變體λC3-SRR與糖多孢紅霉菌突變體M的質(zhì)譜圖，發(fā)現(xiàn)本文構(gòu)建的糖多孢紅霉菌突變體λC3-SRR質(zhì)譜圖中沒(méi)有351.1m/z分子離子峰，說(shuō)明在避免副產(chǎn)物合成方面，

3、定點(diǎn)敲除KR6酶域DNA序列中的SRR三個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)九核苷酸的糖多孢紅霉菌突變體λC3-SRR比完全敲除KR6酶域DNA序列的突變體M要有優(yōu)勢(shì)。KR6酶域DNA序列中SRR三個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)九核苷酸序列敲除的λC3-SRR突變體可合成酮內(nèi)酯類DOEB，說(shuō)明SRR三個(gè)氨基酸是保持KR6酶域還原活性所必需的。比對(duì)分析KR6酶域與放線菌紫素KR酶域及人、大腸桿菌和銅綠假單孢菌的谷胱甘肽還原酶的氨基酸序列，證實(shí)SRR中的RR二個(gè)堿性氨基酸是KR6酶