糖多孢紅霉菌酮還原酶基因的克隆及其在手性醇中的應(yīng)用.pdf

1、具有特定功能基團的手性醇是合成手性藥物的重要中間體，從羰基化合物不對稱還原合成手性醇，已成為手性合成的一個重要部分。在羰基的不對稱催化還原反應(yīng)研究中，生物催化以其溫和的反應(yīng)條件、對環(huán)境的壓力較小和較高的光學(xué)選擇性，在羰基不對稱還原合成中占有很重要的地位。選擇合適的生物催化劑對于生物催化至關(guān)重要。2006年Bali等報道了短鏈脫氫酶家族(short-chaindehydrogenasesuperfamily，SDR)成員之一的糖多孢紅霉菌

2、聚酮合成酶中的酮還原酶對很多的底物，都有比較好的生物選擇性還原能力，特別是對結(jié)構(gòu)中含有環(huán)己酮的底物。 本實驗以糖多孢紅霉菌基因組作為DNA供體，并根據(jù)2005年Alexandros的報道設(shè)計特異性引物，擴增野生型的糖多孢紅霉菌聚酮合成酶中的酮還原酶域基因(eryKR1)。再根據(jù)Genbank中報道的eryKR1基因和放線菌素聚酮合成酶中的酮還原酶基因(ActKR)，設(shè)計了用于定點突變的特異性引物，利用重疊PCR技術(shù)將KR1中決定

3、其底物特異性的位點定點突變?yōu)锳ctKR中決定其底物專一性的那段基因位點，得到突變的KR1片段命為eryKR1M。將其克隆到表達載體pET-28a上，從中挑選陽性克隆菌株pET-eryKR1和pET-eryKR1M進行測序。用同樣的方法構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-GDH作為輔酶再生。將重組質(zhì)粒pET-GDH，pET-eryKR1和pET-eryKR1M轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中進行表達。加定量的IPTG誘導(dǎo)6小時后，通過SDS-PAGE檢測重組蛋白

4、的表達。最后通過發(fā)酵檢驗野生型和突變后的酮還原酶對四種底物(4-氯乙酰乙酸乙酯，苯乙酮，2-辛酮和環(huán)己酮)還原作用。 結(jié)果表明，擴增eryKR1，eryKR1M基因的最佳退火溫度為68℃，GDH基因的最佳退火溫度為54℃。擴增的eryKR1，eryKR1M和GDH基因所對應(yīng)的蛋白序列與報道的同源性高達98％。pET-eryKR1M中的目標基因與Genbank中報道的KR1基因僅在控制底物專一性的位點處不同，被放線菌素聚酮合成酶中