立體選擇性羰基還原酶的篩選及其在手性藥物中間體合成中的應(yīng)用.pdf

1、手性醇含有一個活潑的羥基官能團(tuán)，是大量重要手性藥物的手性合成砌塊。手性醇合成技術(shù)的改良對手性藥物的發(fā)展起到了推動作用。因此，催化潛手性羰基化合物不對稱還原生成手性醇的研究具有非常重要的理論意義和應(yīng)用價值。本論文從立體選擇性羰基還原酶的篩選入手，通過基因挖掘手段獲取目標(biāo)羰基還原酶，并對其進(jìn)行底物特異性和催化性能研究，進(jìn)一步應(yīng)用于手性藥物中間體的合成中，實(shí)現(xiàn)高活性高選擇性催化潛手性羰基化合物不對稱還原合成手性醇。主要內(nèi)容如下：
　　第

2、一部分，立體選擇性羰基還原酶的篩選。通過羰基還原酶產(chǎn)生菌的篩選，從土壤和實(shí)驗(yàn)室保藏菌株中篩選到兩株具有高羰基還原酶活性的新菌株：唐菖蒲伯克霍爾德氏菌Burkholderia gladioli ZJB12126和圓紅冬孢酵母Rhodosporidium toruloides ZJB2014212。利用基因組狩獵以及數(shù)據(jù)庫挖掘技術(shù)，獲得48個目標(biāo)羰基還原酶，構(gòu)成羰基還原酶工具盒。對工具盒中的重組羰基還原酶進(jìn)行底物特異性研究，最終獲得3個具有

3、較高催化活性和立體選擇性以及較廣底物譜的羰基還原酶新酶源：BgADH2、BgADH3和RtSCR9。
　　第二部分，重組羰基還原酶的催化性能研究。對以上3個羰基還原酶進(jìn)行了分離純化和表征，BgADH2、BgADH3和RtSCR9分子量分別為114.2kDa（四聚體）、63.4kDa（二聚體）和123.7kDa（四聚體）；優(yōu)化后的pH分別為6.5、6.5和7.0；優(yōu)化后的溫度分別為35℃、40℃和35℃；35℃下半衰期分別為17h、

4、85h和113h；對應(yīng)的失活活化能分別為1.27kJ/mol、10.6kJ/mol和14.6kJ/mol；少數(shù)金屬離子對酶活有促進(jìn)作用，但EDTA對酶活影響不大，表明三種酶均屬于金屬非依賴型羰基還原酶。BgADH2和RtSCR9對輔酶NADPH的Km比輔酶NADH低20-200倍，屬于輔酶NADPH依賴型；而BgADH3對輔酶NADPH的Km略低于NADH，為NADPH偏好型。
　　第三部分，BgADH2催化合成(2S,3R)-2

5、-苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸甲酯（MBHB）。建立底物2-苯甲酰氨甲基-3-酮-丁酸甲酯（BMOB）和產(chǎn)物高效液相色譜分析方法，利用手性柱Chiralpak AY-H成功將底物產(chǎn)物6種異構(gòu)體分離，確定其出峰順序和保留時間。結(jié)合葡萄糖脫氫酶/葡萄糖偶聯(lián)的輔酶再生體系，選擇水-甲苯兩相體系，pH6.5，35℃下催化60mM底物BMOB，8h后產(chǎn)物濃度為55.1mM，產(chǎn)率91.1％，ee達(dá)99.0%，de達(dá)98.5%，高于文獻(xiàn)報(bào)道。進(jìn)一步對其

6、反應(yīng)機(jī)理和催化機(jī)制進(jìn)行探討，該反應(yīng)是一個動態(tài)動力學(xué)拆分（DYKAT）過程。酶的催化過程通過H的傳遞實(shí)現(xiàn)，底物C=O氧與Try151和Ser138形成氫鍵，從Try151-OH中奪得一個H，輔酶煙酰胺環(huán)C4上的H傳遞給底物C=O碳。
　　第四部分，BgADH3催化合成(R)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯。構(gòu)建羰基還原酶/葡萄糖脫氫酶雙酶共表達(dá)體系E.coli/BgADH3-GDH，優(yōu)化后表達(dá)條件：IPTG0.5mM、誘導(dǎo)溫度28 oC和

7、誘導(dǎo)時間12h。BgADH3酶產(chǎn)量達(dá)55.8U/g濕菌體，GDH酶產(chǎn)量66.5U/g濕菌體。發(fā)酵培養(yǎng)后OD600最高達(dá)36.6，BgADH3體積酶活達(dá)2347.1U/L，GDH體積酶活達(dá)2874.2U/L?？疾炝擞袡C(jī)溶劑對共表達(dá)菌催化反應(yīng)的影響，選擇水-正辛醇兩相體系，優(yōu)化后底物濃度1200mM，反應(yīng)6h，底物完全轉(zhuǎn)化，ee達(dá)99.9%。進(jìn)一步將反應(yīng)放大至1L反應(yīng)體系，采取底物分批補(bǔ)料的策略，20h內(nèi)完全轉(zhuǎn)化2400mM底物，產(chǎn)率91.

8、8%，ee達(dá)99.9%。
　　第五部分，重組羰基還原酶RtSCR9介入的化學(xué)-酶法制備(S)-度洛西汀。合成5種度洛西汀中間體噻吩環(huán)酮類底物N,N-雙甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺鹽酸鹽2a、N-甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺鹽酸鹽2b、3-氯-1-(2-噻吩基)-丙酮2c、3-酮-3-(2-噻吩基)丙酸乙酯2d、3-酮-3-(2-噻吩基)丙腈2e以及相應(yīng)的外消旋醇3a-3e。經(jīng)過篩選，RtSCR9對這些化合物均具

9、有較高的催化活力和選擇性（>99%）。構(gòu)建羰基還原酶/葡萄糖脫氫酶共表達(dá)體系E.coli/RtSCR9-GDH，并應(yīng)用于催化不對稱還原底物2a生成產(chǎn)物(S)-3a。優(yōu)化后葡萄糖添加量6mmol/(mmol2a)、輔酶添加量0.75μmol/(mmol2a)、溫度30 oC、pH6.5、菌體量10g DCW/L和底物濃度1000mM。將反應(yīng)放大至百克級規(guī)模制備(S)-3a，產(chǎn)率92%，ee達(dá)99.9%，時空產(chǎn)率達(dá)22.9mmol/(L·h