羰基還原酶AdhR的重組表達及催化制備培南類藥物中間體.pdf

1、(2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羥基丁酸甲酯((2S，3R)-BHBM)是一種重要的手性化合物，可用于合成碳青霉烯和青霉烯類抗生素，如亞胺培南、法羅培南、美羅培南等。生物催化外消旋2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸甲酯(BOBM)的不對稱還原是制備(2S，3R)-BHBM的重要方法之一。
　　本文首先篩選獲得了一種來源于乳酸桿菌Lactobacillus kefiri DSM20587的NADPH依賴型的羰基還原酶AdhR，能催

2、化BOBM合成(2S，3R)-BHBM，產(chǎn)物對映體過量值(e.e)＞99％。將其在不同的表達體系中進行表達，綜合蛋白表達水平和催化，從中選出酶活最高的重組菌E.coliB L21(DE3)/p ET30a(+)-AdhR，其活力為12.23U/mL。通過產(chǎn)酶條件優(yōu)化，搖瓶培養(yǎng)OD600達到7.18，酶活為38.65U/mL。在此基礎上進行了分批和補料發(fā)酵，通過恒速流加，菌體干重達到41.5g/L，酶活達到221U/mL，比在LB培養(yǎng)基中

3、的酶活提高了18倍。
　　其次，由于不對稱還原BOBM時需要輔酶NADPH的參與，為了避免過多使用價格昂貴的輔酶，構(gòu)建了表達葡萄糖脫氫酶的工程菌，采用酶耦聯(lián)法來實現(xiàn)輔酶的再生。對幾種酶法再生輔酶策略進行考察與比較后選取了其中相對最優(yōu)的雙菌雙酶耦聯(lián)法，以實現(xiàn)輔酶的高效再生。
　　最后，對雙菌雙酶耦聯(lián)催化工藝進行了研究，主要考察雙菌細胞量比例、全細胞用量、NADP+濃度等方面對反應的影響。結(jié)果表明:在450g/L的底物濃度下，采

4、用7.78gDcw/L重組菌E.coli BL21(D E3)/p ET30a(+)-AdhR全細胞進行催化反應，雙菌的投入酶活比為1∶1，輔助底物葡萄糖與底物的摩爾比為1.5∶1，異丙醇用量5％(V/V)，在30℃下，外加0.2mmol/L輔酶NADP+，反應48h后，產(chǎn)物的得率超過95％，產(chǎn)物的時空產(chǎn)率為9.375g/L·h，產(chǎn)物對映體過量值(e.e)＞99％，非對映體過量值（d.e）＞99％，輔酶的總轉(zhuǎn)換數(shù)TTN為8671，高于現(xiàn)