高效毛細(xì)管電泳在手性藥物及藥物中間體分離分析中的應(yīng)用研究.pdf

1、研究目的：用高效毛細(xì)管電泳(HPCE)拆分手性化合物具有簡單、高效、低耗的特性，選擇常用的環(huán)糊精及其衍生物作為手性選擇劑，以具有重要用途的藥物中間體手性連二醇和多糖為主要研究對象，建立該類化合物的基本HPCE分離模式，為手性連二醇藥物中間體的定性、定量分析及中藥多糖的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)制訂奠定基礎(chǔ)。同時，以本科室生產(chǎn)的D-苯丙氨酸藥物為多步不對稱催化反應(yīng)合成體系，將HPCE技術(shù)探索性地用于該反應(yīng)過程的反應(yīng)進(jìn)度監(jiān)測。 研究方法：在手性連二醇

2、的分離分析中，用中性β-CD作手性選擇劑，硼酸為緩沖液，在未涂層空心石英毛細(xì)管柱(58.5cm×75μmi.d.，有效長度48.5cm)上優(yōu)化了影響分離的重要參數(shù)，即β-CD濃度、硼酸濃度及酸度等。建立了一種HPCE對6種典型手性連二醇及3種2,3-二羥基-3-苯丙酸酯重要手性藥物中間體的手性分離模式，并進(jìn)一步測定了合成的(2R,3S)-(-)-2,3-二羥基-3-苯丙酸酯化合物的光學(xué)純度；同時，深入研究了以中性二甲基-β-CD(DM-

3、β-CD)或羥丙基-β-CD(HP-β-CD)作手性選擇劑，硼酸為緩沖液，¨種連二醇對映體樣品在石英毛細(xì)管柱(48.5cm×75μmi.d.，有效長度38.5cm)上的分離行為；此外，以磺化-CD(HS-CD)為手性選擇劑，通過對HS-CD濃度、背景電解質(zhì)濃度及pH值、操作電壓等分離影響因素的研究，優(yōu)化4種重要手性藥物中間體1-苯基-1，2-乙二醇、2-甲基-1-苯基-1，2-乙二醇、1,2-二苯基-1，2-乙二醇和對氯苯基-1，2-乙

4、二醇的分離條件，同時檢測其光學(xué)純度，并與高效液相色譜(HPLC)測定結(jié)果作比較，評價該方法的準(zhǔn)確性。 在中藥多糖的組成分析中，以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)為單糖的衍生化試劑，建立毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)同時分離分析8種常見還原單糖PMP衍生物的方法，并將該方法用于中藥當(dāng)歸多糖(AP)及其進(jìn)一步純化組分APF1、APF2和APF3，大黃多糖(RTP)及其主要組分RTP1，南瓜多糖(PPS)的單糖組成及摩爾比率的測定

5、。 在D-苯丙氨酸反應(yīng)體系的監(jiān)測實驗中，利用HS-β-CD作手性選擇劑，同時分離反應(yīng)原料N-乙酰氨基肉桂酸、N-乙酰苯丙氨酸對映體中間體及產(chǎn)物苯丙氨酸對映體，并以D-α-甲基芐胺作為內(nèi)標(biāo)，測定通過不對稱催化氫化合成的D-苯丙氨酸樣品的光學(xué)純度和可能存在的雜質(zhì)含量。 結(jié)果與結(jié)論：研究表明，β-CD作為9種手性連二醇藥物中間體的手性選擇劑展示了良好的分離能力；其中鄰二醇結(jié)構(gòu)、硼酸濃度和酸度對該對映體分離有很大的影響。在1.7

6、％β-CD、200mM硼酸、pH9.8、電壓15kV、柱溫20℃的分離條件下，首次實現(xiàn)了7種手性連二醇的基線分離，且柱效高(理論塔板數(shù)在10×104以上)、遷移時間重現(xiàn)性好(RSD低于3.0％)，分離結(jié)果令人滿意；進(jìn)一步用所建立的方法測定了(2R,3S)-(-)-2,3-二羥基-3-苯丙酸酯不對稱合成樣品的光學(xué)雜質(zhì)，獲得了滿意的分析結(jié)果。同時，以中性HP-β-CD作為11種連二醇對映體的手性選擇劑，7種對映體成功實現(xiàn)基線分離，甲醇和乙腈

7、有機調(diào)節(jié)劑對HP-β-CD的手性識別有明顯的影響。此外，以HS-CD為1-苯基-1，2-乙二醇、2-甲基-1-苯基-1，2-乙二醇、1，2-二苯基-1，2-乙二醇和對氯苯基-1，2-乙二醇對映體樣品的手性選擇劑，4對對映體可基線分離，且對合成樣品的百分對映體過量(％e.e.)測定值與HPLC法結(jié)果一致。所建立的CZE方法簡單、準(zhǔn)確、分離度好，可用于該手性連二醇的分離和％e.e.值的測定。 在建立單糖PMP衍生物的CZE分析方法中

8、，8種單糖PMP衍生物在pH10.8的150mmol·L-1硼砂緩沖溶液、10kV分離電壓、25℃柱溫的優(yōu)化條件下實現(xiàn)了良好的分離，并證實PPS由木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖醛酸單糖組成，其摩爾比為1.33∶3.12∶7.33∶1.00∶3.67∶6.06。RTP由木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸單糖組成，其摩爾比為1.00∶23.27∶15.93∶2.95∶1.34∶49.07∶

9、2.62∶4.30。RTP1由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸單糖組成，其摩爾比為8.01∶5.01∶30.30∶1.00∶1.56。AP由阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸單糖組成，其摩爾比為12.11∶7.94∶1.00∶7.83∶0.77∶0.33∶3.71。APF1由阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、半乳糖醛酸單糖組成，其摩爾比為11.02∶2.63∶1.00∶3.51∶2.49。A

10、PF2由阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、半乳糖醛酸單糖組成，其摩爾比為18.20∶7.45∶1.00∶8.35∶0.48∶12.31。APF3由阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸單糖組成，其摩爾比為9.42∶8.71∶1.00∶6.03∶0.31∶12.11。該方法具有簡單、快速、高效等優(yōu)點，可用于上述多糖的單糖組成測定及質(zhì)量控制。 同時，D-苯丙氨酸反應(yīng)體系檢測的HPCE研究結(jié)果表明，在3種高取

11、代HS-α-CD、HS-β-CD、HS-γ-CD手性選擇劑中，HS-β-CD顯示了最好的對映選擇性。在pH2.5、35mMTris緩沖液、4％HS-β-CD、-15kV分離電壓、25℃柱溫的條件下，反應(yīng)原料N-乙酰氨基肉桂酸、中間體產(chǎn)物N-乙酰苯丙氨酸對映體及終產(chǎn)物苯丙氨酸對映體得到了完全的基線分離。利用所建立的方法測定了三批不對稱合成樣品D-苯丙氨酸的光學(xué)純度與雜質(zhì)含量，結(jié)果方法的回收率在97.8-103.8％之間，RSD在2.3-5