茶樹(shù)查爾酮異構(gòu)酶、黃酮醇合成酶和無(wú)色花色素還原酶等基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、茶葉是世界上最流行的無(wú)酒精健康飲品之一,含有許多有價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物,如類黃酮、咖啡堿等.其中類黃酮是由類苯基丙烷等前體縮合而成一組天然化合物,它們?cè)谥参锏纳L(zhǎng)、發(fā)育和防御疾病等方面有著重要作用.而且,這些化合物具有較強(qiáng)的抗氧化活性,對(duì)于改善人體健康的效果也非常突出.因此,分離克隆茶樹(shù)類黃酮生物合成途徑中相關(guān)酶的基因具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值.主要研究結(jié)果如下: 1. 在原有茶樹(shù)EST基礎(chǔ)上,利用T<,4>RNA連接酶介導(dǎo)的5

2、'RACE技術(shù)獲得了茶樹(shù)查爾酮異構(gòu)酶(CHI)基因的全長(zhǎng)序列,其在GenBank的登錄號(hào)是DQ904329,其序列全長(zhǎng)1163 bp,其中開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)723 bp,編碼240個(gè)氨基酸,3'端有一個(gè)明顯的多聚腺苷酸加尾信號(hào),推測(cè)的蛋白分子量約為26.4 kD,pI為5.19.序列分析表明它在GenBank已登錄的植物中與番茄CHI基因序列的親緣關(guān)系比較近. 2. 根據(jù)原有EST設(shè)計(jì)引物,利用RT-PCR技術(shù)獲得了茶樹(shù)黃酮醇合成酶(

3、FLS)基因全長(zhǎng)序列,在GenBank登錄號(hào)為EF205150,其序列全長(zhǎng)1317 bp,其中開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)996 bp,編碼331個(gè)氨基酸,3'端有一個(gè)明顯的多聚腺苷酸加尾信號(hào),推測(cè)的蛋白分子量約為37.5 kD,DI為5.80.序列分析表明它在GenBank已登錄的植物中與葡萄FLS基因序列的親緣關(guān)系比較近.將該基因重組到表達(dá)載體pEI=32a(+)中進(jìn)行原核表達(dá),經(jīng)IPRG誘導(dǎo)、SDS-PAGE檢測(cè),結(jié)果表明茶樹(shù)黃酮醇合成酶基因能在

4、大腸桿菌BL21中表達(dá),電泳檢測(cè)到一條大約61kD的外源蛋白,與預(yù)測(cè)的融合蛋白分子量相符. 3. 利用3'RACE技術(shù)獲得了茶樹(shù)無(wú)色花色素還原酶(LAR)的3'端,將其與原有EST片段拼接,得到了LAR基因的全長(zhǎng)序列,其在GenBank的登錄號(hào)為EF205148,其序列全長(zhǎng)1 301 bp,其中開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)1 029 bp,編碼342個(gè)氨基酸,3'端有一個(gè)明顯的多聚腺苷酸加尾信號(hào),推測(cè)的蛋白分子量約為37.5 kD,pI為5.8

5、1.同源性分析表明得到的LAR序列與亞洲棉(Gossypiumarboreum)、洋莓(Fragaria ananassa)和葡萄(Vitis vinifera)的氨基酸序列相似性分別為70﹪、68﹪、71﹪.十種植物的聯(lián)配表明其氨基酸序列較為保守. 4. 利用半定量PCR技術(shù)檢測(cè)了類黃酮的主要成分-兒茶素含量不同4個(gè)茶樹(shù)品種中與類黃酮合成相關(guān)的查爾酮合成酶(CHS)、黃烷酮3-羥化酶(F3H)、黃酮醇合成酶(FLS)、二氫黃酮