紅蓋鱗毛蕨查爾酮異構(gòu)酶(DeCHI)基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、黃酮類化合物是一類廣泛存在于植物中的次生代謝產(chǎn)物，對(duì)于植物的自身防御和生理調(diào)節(jié)具有重要的作用。黃酮類化合物還具有抗氧化、抑菌消炎、抑制腫瘤細(xì)胞活性、抗HIV活性等功能，且毒性較小，藥用價(jià)值較高。種子植物中黃酮代謝途徑已研究的較為透徹，作為黃酮含量較高的蕨類植物，其黃酮代謝途徑尚不清楚。查爾酮異構(gòu)酶（CHI）是黃酮代謝途徑的關(guān)鍵限速酶之一，其主要功能為催化柚皮素查爾酮轉(zhuǎn)化為柚皮素，生成的柚皮素是后續(xù)多條代謝通路的前體物質(zhì)，種子植物中的CH

2、I基因?qū)儆诓闋柾悩?gòu)酶基因家族，分為TypeΙ、TypeⅡ、TypeⅢ、TypeⅣ四個(gè)類型，具有不同的生物學(xué)功能。然而，蕨類植物中CHI基因的結(jié)構(gòu)特征、類型及其功能尚不清楚，研究蕨類植物中CHI基因，對(duì)闡明黃酮代謝途徑的分子機(jī)制，揭示CHI基因的功能及其演化均具有重要的科學(xué)意義。
　　本研究以紅蓋鱗毛蕨為實(shí)驗(yàn)材料，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、PCR及高效液相色譜技術(shù)對(duì)查爾酮異構(gòu)酶基因（CHI）進(jìn)行克隆及表達(dá)分析，并對(duì)該基因序列的結(jié)構(gòu)及蛋白結(jié)構(gòu)

3、和蛋白功能等方面做了生物信息學(xué)分析。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果主要有以下幾個(gè)方面：
　　1.利用Ilumina Hiseq2000平臺(tái)對(duì)紅蓋鱗毛蕨拳卷葉進(jìn)行測(cè)序，獲得8.5G數(shù)據(jù)量。對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝拼接，共獲得Unigene143604條。依據(jù)注釋結(jié)果分析獲得CHI可能性基因6條，經(jīng)分析選取其中3條作為CHI的候選基因。
　　2.利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，成功克隆到三條基因的ORF序列，將三條基因序列重新命名為：DeCHI1、DeCHI

4、2和DeCHI3。生物信息學(xué)分析表明，DeCHI1的ORF全長(zhǎng)651bp，編碼216個(gè)氨基酸；DeCHI2的ORF全長(zhǎng)822bp，編碼273個(gè)氨基酸；DeCHI3的ORF全長(zhǎng)738bp，編碼245個(gè)氨基酸。聚類分析表明， DeCHI1與TypeΙ和TypeⅡ呈并列關(guān)系；DeCHI2屬于Type IV型；DeCHI3屬于Type III型。
　　3.本研究成功構(gòu)建3條CHI的重組質(zhì)粒pET32a-DeCHI1、pET32a-DeCH

5、I2、pET32a-DeCHI3，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到BL21感受態(tài)細(xì)胞中構(gòu)建原核表達(dá)載體，并用IPTG誘導(dǎo)獲得融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE鑒定獲得蛋白大小分別為39.7kDa、45.0kDa、43.1kDa，與預(yù)期的蛋白大小相一致。
　　4.本研究以柚皮素查爾酮和異甘草素為底物，分別采用3條基因純化后的融合蛋白對(duì)底物進(jìn)行催化，催化產(chǎn)物上高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明：①DeCHI1、DeCHI2和DeCHI3的蛋白酶均能

6、催化柚皮素查爾酮轉(zhuǎn)化為柚皮素，同時(shí)也能催化異甘草素轉(zhuǎn)化為甘草素，與目前報(bào)道的種子植物Type III CHI和Type IV CHI蛋白酶沒(méi)有催化活性不同；②DeCHI1不僅能催化柚皮素查爾酮，還能催化異甘草素轉(zhuǎn)化為甘草素，與現(xiàn)有報(bào)道僅豆科植物TypeⅡ可催化異甘草素的結(jié)論不同，進(jìn)化樹(shù)聚類分析結(jié)果顯示DeCHI1與種子植物的TypeⅠ和TypeⅡ在同一簇中，推測(cè)其具有TypeⅠ和TypeⅡ的功能，推測(cè)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符；③在DeCHI1