藏藥紅景天中查爾酮合成酶基因的克隆與分析.pdf

1、紅景天是傳統(tǒng)的常用中藥之一，具有重要的藥用價(jià)值，其中黃酮類化合物是紅景天中的主要有效成份。近年來(lái)對(duì)黃酮類化合物的研究，特別是如何提高藥用植物中黃酮的含量已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。對(duì)于提高黃酮的相對(duì)百分含量的研究，前人已有大量的報(bào)道，事實(shí)證明采用生理生化途徑調(diào)控黃酮相對(duì)百分含量是一種有效的方法。同時(shí)，利用植物基因工程技術(shù)對(duì)植物進(jìn)行遺傳改良或在分子水平上調(diào)控植物黃酮合成途徑中關(guān)鍵酶的活性，從而提高黃酮含量也是一種行之有效的方法。黃酮的合成代

2、謝中涉及到十幾種酶，而查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）是紅景天黃酮合成代謝途徑中的關(guān)鍵酶。因而，開(kāi)展紅景天查爾酮合成酶的研究具有重要的理論意義與實(shí)踐價(jià)值。
　　本研究以此為基礎(chǔ)，以長(zhǎng)鞭紅景天為實(shí)驗(yàn)材料，采用改進(jìn)的CTAB法提取DNA和RNA。利用RT－PCR技術(shù)提取出cDNA，利用一對(duì)簡(jiǎn)并引物分離出查爾酮合成酶基因的部分序列，采用單側(cè)寡聚核苷酸嵌套 PCR(single oligonucleotide n

3、ested PCR，SON－PCR)方法從紅景天中分離出查爾酮合成酶基因的DNA全長(zhǎng)序列。再利用組織培養(yǎng)得到的紅景天進(jìn)行黃酮含量測(cè)定，得到的主要結(jié)果如下：
　　1．采用實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)的CTAB法提取紅景天的DNA和RNA，提取的DNA經(jīng)電泳檢測(cè)，有清晰的主帶，說(shuō)明提取的DNA質(zhì)量較好。抽提的RNA經(jīng)紫外吸收測(cè)量，A260/A280接近2.0；反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA經(jīng)引物擴(kuò)增，出現(xiàn)清晰的條帶，說(shuō)明提取的RNA與DNA的純度高，質(zhì)量好。該法

4、簡(jiǎn)便易行，適合于富含多糖，多酚植物材料的核酸提取。
　　2．采用1對(duì)簡(jiǎn)并引物，以紅景天DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了860 bp的CHS的基因片段，GenBank登錄號(hào)為：EF070214。
　　3．利用SON－PCR技術(shù)首次從紅景天中分離出黃酮合成代謝的第一個(gè)關(guān)鍵酶基因CHS基因，命名為Rhchs，其序列全長(zhǎng)為2443 bp，包括682 bp的啟動(dòng)子區(qū)、1143 bp的編碼區(qū)和3’ UTR區(qū)。預(yù)測(cè)序列編碼381個(gè)氨基酸

5、，其氨基酸組成與其他已知的高等植物的查爾酮合成酶具有很高的同源性，與葡萄、山茶花、杜鵑和牽牛的同源性分別為87％、87%、86%、85%，且大部分氨基酸序列保守。
　　4．將本研究獲得的查爾酮合成酶基因的保守序列與另外10個(gè)物種的序列進(jìn)行比對(duì)與聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)11個(gè)物種共分為3個(gè)相似類群，其中同屬于單子葉植物的構(gòu)成了一個(gè)分支，屬于十字花科的植物構(gòu)成另一個(gè)分支；長(zhǎng)春花、柑橘、胡桃和杜鵑花構(gòu)成一個(gè)類群；而紅景天和覆盆子構(gòu)成一個(gè)分支，

6、可以推定紅景天查爾酮合成酶與此物種具有較高的相似性。
　　5．紅景天查爾酮合成酶基因（Rhchs）的組織結(jié)構(gòu)分析顯示由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子組成，起始密碼子（ATG）和終止密碼子（TAA）分別位于第1個(gè)外顯子和第2個(gè)外顯子內(nèi)。且第二個(gè)外顯子比第一個(gè)外顯子更長(zhǎng)更保守。
　　6．根據(jù)紅景天查爾酮合成酶基因（Rhchs）序列，成功構(gòu)建了Rhchs基因的原核表達(dá)載體pZP211：Rhchs。
　　7．對(duì)紅景天進(jìn)行黃酮含量的測(cè)定