葡萄果實(shí)查耳酮合成酶研究——基因克隆、表達(dá)、純化、抗體的制備以及UV、糖對(duì)葡萄果實(shí)查耳酮合成酶的調(diào)節(jié).pdf

1、查耳酮合成酶(CHS，E.C.23.1.74)是植物類黃酮代謝途徑的入口酶，也是此途徑的第一個(gè)關(guān)鍵限制酶，它參與了以C<,15>為基本骨架的類黃酮物質(zhì)的形成，它在研究植物類黃酮代謝途徑調(diào)控機(jī)制具有十分關(guān)鍵的作用。本文通過構(gòu)建chs原核表達(dá)載體進(jìn)行原核表達(dá)，分離純化得到高純度的CHS蛋白。通過免疫兔子制備多克隆抗體，并對(duì)血清進(jìn)行了分離純化，得到了葡萄中CHS特異性多克隆抗體?？贵w在葡萄不同組織部位均檢測(cè)到一條43 kD的蛋白條帶。并在此基

2、礎(chǔ)上探討了查耳酮合成酶在葡萄果實(shí)的亞細(xì)胞定位以及UV、蔗糖處理對(duì)葡萄果實(shí)CHS的調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步研究葡萄果實(shí)中查耳酮合成酶在類黃酮代謝途徑中的生理功能奠定了良好的實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)對(duì)葡萄chs基因全序列進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物直接連接到克隆載體pMD18-T，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)過藍(lán)白斑篩選、小量提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定以及基因測(cè)序鑒定得到chs全長(zhǎng)基

3、因，命名為pMK-chs。 通過使用限制性內(nèi)切酶(EcRⅠ和Sal Ⅰ)將質(zhì)粒pMD-chs進(jìn)行雙酶切，得到帶有雙酶切粘性末端的chs基因片斷，同樣方法處理表達(dá)載體pET-30a(+)。兩基因片段純化后用T<,4>DNA連接酶進(jìn)行定向連接，得到重組質(zhì)粒，命名為pET

4、驗(yàn)證，得到純化的CHS蛋白。 以純化的CHS蛋白為抗原，免疫純種新西蘭白兔，制備CHS多克隆抗體。依次經(jīng)過(NH<,4>)<,2>SO<,4>分級(jí)沉淀、DEAE-Sepharose FF離子交換層析純化，得到抗體lgG。純化后的抗體通過酶聯(lián)免疫、蛋白質(zhì)斑點(diǎn)雜交和Western blot分析，表明具有良好的效價(jià)和較高的靈敏度與特異性。葡萄果實(shí)不同組織部位和果實(shí)發(fā)育過程中的CHS的蛋白質(zhì)免疫印跡分析表明，抗體均能特異性地檢測(cè)到一條4

5、31 kD的蛋白條帶。在葡萄果實(shí)發(fā)育過程中，幼果期CHS蛋白含量很低，進(jìn)入轉(zhuǎn)色期開始大量增加，這種狀態(tài)一直持續(xù)到果實(shí)成熟采收。 以盛花后70 d的赤霞珠(Vitis viniferα.L.cv.Cabernet Sauvienon)果實(shí)為試材，應(yīng)用紫外線(UV)照射技術(shù)，研究了UV照射對(duì)葡萄果實(shí)類黃酮代謝產(chǎn)物的影響。同時(shí)應(yīng)用膠體金免疫電子顯微鏡操作技術(shù)首次對(duì)CHS在葡萄果實(shí)(果皮和果肉)內(nèi)進(jìn)行了亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明UV誘導(dǎo)了果實(shí)

6、類黃酮代謝產(chǎn)物(總酚、總類黃酮、總花色苷)的大量合成，類黃酮代謝入口酶一查耳酮合成酶轉(zhuǎn)錄水平和蛋白含量明顯增加。膠體金免疫電鏡顯示，CHS主要存在于葡萄果實(shí)細(xì)胞的質(zhì)體(葉綠體、有色體)、細(xì)胞質(zhì)、次生壁、粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在細(xì)胞壁和液泡中含量分布較少。 以幼果期(20 d)和轉(zhuǎn)色期(70 d)赤霞珠葡萄果實(shí)為試材，應(yīng)用糖(蔗糖、葡萄糖、果糖)滲透完整果實(shí)的實(shí)驗(yàn)體系，研究了糖處理對(duì)葡萄果實(shí)類黃酮代謝的影響。結(jié)果表明，外施蔗糖處理促進(jìn)了葡萄