烏拉爾甘草細(xì)胞培養(yǎng)與查爾酮異構(gòu)酶基因及其啟動(dòng)子克隆.pdf

1、甘草是世界上應(yīng)用最廣泛的中草藥之一，屬溫補(bǔ)性中藥，也廣泛用于食品、煙草和化妝品行業(yè)。利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來(lái)生產(chǎn)甘草活性物質(zhì)是目前解決甘草資源問(wèn)題最有潛力的方法之一。由于懸浮細(xì)胞中甘草黃酮的含量低，使得產(chǎn)業(yè)化的應(yīng)用成本較高，本文旨在建立甘草細(xì)胞培養(yǎng)高產(chǎn)合成甘草黃酮的方法，探索甘草黃酮合成的調(diào)控機(jī)理，主要圍繞烏拉爾甘草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的建立、懸浮系非結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)分析、甘草黃酮有效提取方法的建立、查爾酮異構(gòu)酶及其啟動(dòng)子的克隆等方面開(kāi)展了較為系統(tǒng)的研

2、究，取得了以下的成果：
　　（1）在建立了穩(wěn)定的烏拉爾甘草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上，探討了懸浮培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)、基質(zhì)消耗及產(chǎn)物合成的動(dòng)態(tài)變化，建立了Logistic方程為基礎(chǔ)的甘草細(xì)胞生長(zhǎng)、基質(zhì)消耗與黃酮合成的動(dòng)力學(xué)模型，并采用Origin Pro8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，模型擬合值和試驗(yàn)值吻合較好，表明本實(shí)驗(yàn)所建立的動(dòng)力學(xué)模型能很好地符合實(shí)際的培養(yǎng)過(guò)程。
　?。?）采用雙因素?zé)o重復(fù)試驗(yàn)篩選了烏拉爾甘草懸浮細(xì)胞黃酮類(lèi)化

3、合物提取最佳工藝。試驗(yàn)結(jié)果表明以70%的乙醇作為提取劑，在料液比1:10的條件下進(jìn)行超聲提取，甘草中黃酮類(lèi)化合物能得到充分分離。
　?。?）克隆出甘草細(xì)胞中chi基因的cDNA序列，序列包含657 bp的完整開(kāi)放閱讀框，共編碼218個(gè)氨基酸，核酸、蛋白序列比對(duì)結(jié)果顯示，甘草CHI蛋白序列與大豆和菜豆相似度達(dá)97%和93%，分子量和等電點(diǎn)分別為23.18 kD和6.23，其三級(jí)結(jié)構(gòu)呈一個(gè)倒置型花束，典型有功能的CHI蛋白的空間結(jié)構(gòu)。