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1、隨著抗生素耐藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重, 迫切需要尋找新型抗菌藥物。酮內(nèi)酯類(lèi)抗生素在對(duì)付耐藥菌方面作用突出,是最有希望的新型抗菌藥物。利用同源重組方已構(gòu)建了糖多孢紅霉菌M,可以合成一種新酮內(nèi)酯類(lèi)化合物——3-脫氧-3-羰基-紅霉內(nèi)酯B,然而產(chǎn)量較低,產(chǎn)物沒(méi)有抑菌活性。通過(guò)60Co-γ射線(xiàn)對(duì)糖多孢紅霉菌M進(jìn)行誘變,選育出的糖多孢紅霉菌963和967雖然產(chǎn)物具有抑菌活性,但產(chǎn)量有待進(jìn)一步提高。
通常復(fù)合誘變具有較好的誘變效果。本實(shí)驗(yàn)選用
2、60Co-γ射線(xiàn)對(duì)分別糖多孢紅霉菌963和967進(jìn)行重復(fù)誘變選育,以期獲得高產(chǎn)突變株。在對(duì)孢子稀釋液的選擇上,分別用生理鹽水和5%、10%、20%、40%和80%甘油適當(dāng)稀釋孢子,以不同劑量輻照處理(不輻照的樣品為空白對(duì)照),涂平板,計(jì)數(shù)并計(jì)算孢子致死率,選擇適宜的孢子稀釋液和適宜的輻照劑量;采用適宜的條件對(duì)孢子進(jìn)行重復(fù)誘變處理,并結(jié)合一定濃度的鏈霉素R3M抗性平板篩選突變株。觀(guān)察菌株形態(tài),取誘變株發(fā)酵液做枯草桿菌抑菌試驗(yàn),篩選正突變,
3、計(jì)算突變率,并研究60Co-γ射線(xiàn)對(duì)糖多孢紅霉菌963和967的重復(fù)誘變效應(yīng)。為了初步探討鏈霉素抗性篩選方法,以糖多孢紅霉菌963為研究對(duì)象,同時(shí)采用在R3M平板中逐漸提高鏈霉素濃度的方法對(duì)誘變株進(jìn)行篩選。
測(cè)定鏈霉素最低抑制濃度的實(shí)驗(yàn)表明,隨著鏈霉素濃度的增加,其對(duì)糖多孢紅霉菌963和967的抑制作用增強(qiáng)。當(dāng)鏈霉素濃度分別達(dá)到140μg/mL和120μg/mL時(shí),平板上無(wú)可再生菌株,為最小致死濃度。在固定鏈霉素濃度抗性篩
4、選法實(shí)驗(yàn)中,選用130μg/mL和110μg/mL鏈霉素抗性平板對(duì)誘 變株進(jìn)行篩選;在增加鏈霉素濃度抗性篩選法實(shí)驗(yàn)中,以糖多孢紅霉菌963作為研究對(duì)象,將濃度由130μg/mL逐漸增加到140μg/mL、150μg/mL和160μg/mL。
通過(guò)比較生理鹽水和5%、10%、20%、40%和80%甘油對(duì)輻照孢子生長(zhǎng)的影響以及實(shí)驗(yàn)的可操作性,發(fā)現(xiàn)生理鹽水作孢子稀釋液為宜。實(shí)驗(yàn)表明,輻照劑量越高,孢子致死率越高。當(dāng)劑量為500G
5、y時(shí),糖多孢紅霉菌963和967的孢子致死率均為90%左右,選擇為最佳誘變劑量。
利用60Co-γ對(duì)糖多孢紅霉菌963的重復(fù)誘變選育時(shí),獲得了一株正突變株,其抑菌活性明顯增強(qiáng),遺傳穩(wěn)定,正突變率達(dá)2.01‰;有12株形態(tài)變異株,其產(chǎn)孢時(shí)間、孢子顏色等均發(fā)生較大變化,形態(tài)變異率為24.1‰。與單次誘變相比,重復(fù)誘變獲得了較好效果。
增加鏈霉素抗性選擇壓篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與固定選擇壓相比,雖然形態(tài)變異有了顯著提高
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