N+、α粒子、60Co-γ對陸地棉花粉的誘變效應研究及誘變后代鑒定.pdf

1、誘變是棉花育種中創(chuàng)造變異的重要手段之一。棉花輻射誘變一般以種子為材料,但輻照種子長成的M1植株易出現(xiàn)嵌合體?；ǚ壑泻芯毎?對輻射誘變敏感,突變的精細胞可通過受精遺傳給后代,有助于提高選擇效率和加速輻射育種進程。此外,輻照花粉也是創(chuàng)造非整倍體等遺傳材料的有效方法。60Co-γ射線是棉花育種中應用最為廣泛的誘變手段。離子束注入技術(shù)在植物、微生物誘變研究方面已取得豐碩成果。但是由于離子束穿透能力很弱,它能否進入細胞,一直存在爭議.而且低能

2、離子與生物體的相互作用涉及復雜的生物學效應,離子注入后對植物細胞的直接損傷及誘變效應方面的機理研究還很缺乏。α粒子屬于直接電離粒子,具有較高的傳能線密度,能引發(fā)細胞之間的輻射信號傳導及其細胞間旁效應的產(chǎn)生。由于α粒子的穿透力較弱,α粒子的輻射生物學研究多集中在哺乳動物細胞方面,在植物上研究α粒子的生物效應尚少有報道,尚不清楚它是否能作為一種有效的植物誘變源。本研究以陸地棉為材料,分別用N+、α粒子和60Co-γ射線作為輻射源,從花粉粒表

3、面結(jié)構(gòu)、內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)、花粉粒萌發(fā)率、授粉后萌發(fā)花粉管的數(shù)量和長度、花粉管微絲骨架、花粉管Ca2+濃度梯度以及N+注入后引起M1代DNA和RNA水平上的變異等方面研究N+、α粒子及60Co-γ射線輻射對花粉粒的誘變生物學效應,比較三種誘變源的誘變機理,為棉花誘變育種提供了新的方法.對60Co-γ射線誘變花粉后代的主要農(nóng)藝性狀的變異規(guī)律進行了研究,豐富了花粉誘變育種技術(shù).研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　 1.棉花雄性配子體發(fā)生和發(fā)育的檢測

4、方法
　　 將熒光染料DAPI染色DNA、羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽染色花粉管微絲、Fluo-3am染色花粉管中Ca2+、熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡等方法應用到檢測棉花雄性配子體的發(fā)生發(fā)育過程,發(fā)現(xiàn)陸地棉花蕾的大小與花粉母細胞及雄配子體的發(fā)育程度步,同時存在單核花粉粒、雙核花粉粒和三核花粉粒等三種不同類型的花粉粒；陸地棉花粉管內(nèi)微絲主要以微絲束的方式沿花粉管連續(xù)縱向排列,花粉管頂端10-20μm的區(qū)域內(nèi),不存在微絲網(wǎng)絡；花粉管內(nèi)

5、的游離Ca2+呈現(xiàn)頂端Ca2+濃度較近頂端高的極性分布。研究的方法和結(jié)果為開展與棉花花粉粒有關的生殖生物學研究提供了途徑和依據(jù)。
　　 2.N+、α粒子和60Co—γ對陸地棉花粉的誘變效應研究及誘變后代鑒定
　　 2.1 以10、20和30 keV的N+注入陸地棉花粉粒。發(fā)現(xiàn)N+通過刻蝕方式作用于花粉粒,對花粉內(nèi)部結(jié)構(gòu)、花粉活力以及花粉管的微絲骨架結(jié)構(gòu)均產(chǎn)生程度不同的影響,影響程度與注入能量有關,能量越大,對花粉的損傷效

6、應越明顯。
　　 2.2 通過對20 keV的N+注入后的花粉授粉后發(fā)育的M1(胚珠)DNA的SSR標記分析,在DNA水平上檢測N+誘變后的多態(tài)性變化,結(jié)果表明,N+注入陸地棉花粉后再給雌蕊授粉,在一定程度上改變了花粉中精細胞的DNA序列,會對胚珠的DNA多態(tài)性產(chǎn)生影響。說明N+注入花粉,能產(chǎn)生可遺傳的變異；通過抑制消減雜交技術(shù),獲得20 keV的N+誘變陸地棉花粉后M1代特異表達的cDNA片段,在mRNA水平上檢測N+的誘變效

7、應。已測序的有50個縮減cDNA克隆中,52％的序列在數(shù)據(jù)庫中都有同源的棉屬來源的EST。38個EST與其他物種已知基因部分區(qū)域的同源性為56％-100％,占總EST的76％；5條EST序列能在數(shù)據(jù)庫中檢索到同源性序列,但其功能尚不清楚；9個EST能在數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)為推測蛋白；4個EST在GenBank中沒有查到對應的同源序列(序列號分別為:GH291233；GH291234；GH291235和GH291236).
　　 2.3

8、以陸地棉花粉為材料,研究不同注入機各參數(shù)(離子能量、總劑量、劑量率、脈沖劑量、間隔時間)對陸地棉花粉注入效應的影響。發(fā)現(xiàn)N+注入時的抽真空過程對陸地棉花粉活力無影響,離子能量、總劑量、劑量率、脈沖劑量和注入間隔時間等5個參數(shù)均在不同程度上影響注入結(jié)果。5個參數(shù)對注入效果的影響順序為能量>劑量率>總劑量>脈沖劑量>間隔時間。因此,在實際的離子注入時,應根據(jù)實驗目的綜合考慮這些參數(shù)的效應,比如采用高能量-低劑量-長間隔時間可能是提高注入花粉

9、活力較為有效的方法。
　　 2.4 以20 Gy的60Co-γ射線輻照陸地棉花粉粒,發(fā)現(xiàn)60C0-γ射線對花粉粒的表面結(jié)構(gòu)無影響；但對花粉粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯的破壞作用,內(nèi)壁變薄,不規(guī)則且部分向內(nèi)凹陷,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)解聚,內(nèi)含物增多；與對照(自然花粉)相比,花粉?；盍档土?8％授粉后胚珠的DNA多態(tài)性明顯增加；M1發(fā)芽率降低了41.03%。棉株的主根長,最長側(cè)根長度,平均側(cè)根長度,側(cè)根數(shù)和株高等分別比對照下降了22.24%,18.93%

10、,11.80％,28.02％和23.05％。雄性不育株占56.7％。鈴數(shù)的變異系數(shù)最大,達119.79％,比對照增加103.21％,其次為衣分、莖粗、籽指、果枝數(shù)、最長果枝,變異系數(shù)分別比對照增加了74.59％、75.96％、69.83％、33.25％、29.62％；株高變異系數(shù)最小(20.15％),比對照增加了11.843％.M2代植株中的雄性不育株占24％。M2代鈴數(shù)的變異系數(shù)最大(33.08％),較對照增加21.94％,其次為籽棉

11、產(chǎn)量、果枝數(shù)、株高、單鈴重,分別較對照增加了16.26％、3.83％、3.99％、7.25％。衣分的變異系數(shù)最小(4.90％),比對照增加0.50％.M2代各農(nóng)藝性狀的變異系數(shù)及變異幅度均小于M1代。M3代的株高、果枝數(shù)、鈴數(shù)、產(chǎn)量和單鈴重5個性狀的均值皆低于對照,衣分均值高于對照,降低與升高的幅度皆小于M2代。在M1、M2、M3代等3個誘變后代中,M3代各農(nóng)藝性狀的變異系數(shù)最小,M1代的變異系數(shù)最大。M3代大多數(shù)的變異株系表現(xiàn)穩(wěn)定,基

12、本無分離,因此,在誘變后代選擇上,M1代種子可混收,M2代再分單株收獲。M3代可獲得部分純合株系。
　　 2.5 以陸地棉成熟花粉粒為材料,結(jié)合超薄切片、熒光染色等技術(shù)。通過觀察花粉的表面結(jié)構(gòu)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、以及花粉萌發(fā)出的花粉管的生長和內(nèi)部的微絲骨架結(jié)構(gòu)的變化,分析α粒子及60Co-γ射線的誘變效應,以及誘變效應與輻照劑量間的關系,比較兩種輻射源產(chǎn)生的輻射效應及機理方面的差異。結(jié)果表明,α粒子是通過刻蝕方式作用于花粉粒,不同于60

13、Co-γ射線通過高能量射線穿透花粉粒作用于花粉粒。兩種輻照方式均通過對花粉的內(nèi)部結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損傷使花粉萌發(fā)率及萌發(fā)花粉管的數(shù)目下降,破壞花粉管微絲骨架。相同劑量時,60Co-γ射線的損傷作用大于α粒子的作用。
　　 2.6 從誘變育種的角度來說,α粒子由于其發(fā)射儀器的限制,每次處理的花粉數(shù)量有限,不能在田間大量授粉；N+雖然對花粉的損傷效應明顯,但田間授粉,后代變異不明顯；20 Gy的60Co-γ射線是較為適宜的陸地棉成熟花粉育種的