白念珠菌CYP51免疫原性肽多克隆抗血清的制備與鑒定.pdf

1、白念珠菌是臨床最常見的致病真菌，在系統(tǒng)性真菌感染病例中，有50％-60％的病例是由白念珠菌感染引起的，同時由于長期廣泛的預防性和治療性使用氮唑類抗真菌藥(如氟康唑)，90％以上的白念珠菌一經(jīng)用藥會出現(xiàn)不同程度的耐藥性。 文獻表明，白念珠菌CYP51蛋白與耐藥作用關(guān)系非常密切。白念珠菌CYP51蛋白即羊毛甾醇14α-去甲基化酶，藥物與CYP51中的血紅素鐵相結(jié)合，阻止酶底物羊毛甾醇及分子氧與CYP51結(jié)合，影響羊毛甾醇14α-甲基

2、的羥基化反應，進而抑制真菌細胞膜中的主要甾醇成分麥角甾醇的生物合成，從而產(chǎn)生抗真菌作用。 從基因水平上研究白念耐藥的分子機理，必須對相關(guān)基因的蛋白表達差異進行鑒定?？贵w作為體液免疫應答的主要效應分子，能特異性地識別和結(jié)合相應抗原。過去的研究證明：通過免疫組化方法可以研究某個基因編碼產(chǎn)物．蛋白的組織分布、細胞內(nèi)定位；通過免疫共沉淀方法可以知道與它相互作用的蛋白；通過各種阻斷實驗或中和實驗可以知道蛋白的功能。 本文采用融合蛋

3、白表達技術(shù)，使用Goldgene等軟件對CYP51基因的抗原表位進行多點預測，確定對應于該氨基酸序列的cDNA序列，從而設計引物，采用PCR法從白念珠菌基因組中擴增出目的基因；選擇常用于融合蛋白表達的pGEX系列載體，進行目的基因片段與質(zhì)粒的切割與連接，成功構(gòu)建了表達載體；轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞并篩選轉(zhuǎn)化子，同時通過選擇最佳誘導時機、最佳收菌時間和最佳IPTG濃度、探索出了適合GST-CYP51融合蛋白的最佳誘導條件，進而培養(yǎng)并誘導融合