白念珠菌CYP51功能性氨基酸殘基與新型唑類抗真菌藥物相互作用研究.pdf

1、羊毛甾醇14α-去甲基化酶(P450<,14DM>)是抗真菌藥物作用的重要靶標(biāo)，該酶的抑制劑氮唑類化合物是抗真菌藥物研究中的重要熱點(diǎn)領(lǐng)域。先后出現(xiàn)了酮康唑、氟康唑、伊曲康唑和活力康唑等一系列主要臨床藥物。氟康唑的抗菌譜相對(duì)較窄，對(duì)曲霉菌等真菌活性很低，且易產(chǎn)生耐藥性；伊曲康唑也存在口服生物利用度不穩(wěn)定等問題。隨著臨床上非白色念珠菌感染率迅速增加，以及氟康唑耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，迫切需要開發(fā)出新一代廣譜、低毒、高效的氮唑類抗真菌藥物。但是，

2、目前，國內(nèi)外專家僅限于知道氮唑類藥物是靶酶作用底物的不可逆、競爭性抑制劑；通過氮唑環(huán)上氮原子與靶酶的血紅素輔基 Fe 原子形成配位鍵結(jié)合，使血紅素失去與氧原子結(jié)合的機(jī)會(huì)，阻斷底物的羥基化反應(yīng)，致使真菌體內(nèi)麥角甾醇合成受阻，導(dǎo)致膜通透性和膜上多種酶活性改變，從而抑制真菌的生長。對(duì)氮唑類藥物的抗菌活性分子機(jī)理研究較少。而氮唑類抗真菌藥物的作用分子機(jī)理又是該類藥物創(chuàng)新性研究的核心技術(shù)；因此，近年來國內(nèi)外學(xué)者在這方面進(jìn)行了大量的探索工作。

3、 據(jù)報(bào)道，氮唑類藥物的分子結(jié)構(gòu)中，三唑環(huán)上的 4 位 N 原子與靶酶活性位點(diǎn)卟啉Fe 原子配位結(jié)合，間二氟苯基與靶酶活性位點(diǎn)的疏水空穴形成疏水相互作用，叔醇羥基為該類藥物產(chǎn)生活性所必需；而結(jié)構(gòu)中變化最大，構(gòu)效關(guān)系最不明確的是其側(cè)鏈部分。目前已經(jīng)報(bào)道有十幾種結(jié)構(gòu)類型的側(cè)鏈，并且有多個(gè)結(jié)構(gòu)差異很大的類型顯示有較強(qiáng)的抗真菌活性。其中，發(fā)現(xiàn)艾迪康唑等高活性化合物分子結(jié)構(gòu)中的2位叔醇羥基和3位側(cè)鏈?zhǔn)莾蓚€(gè)活性極其重要部位，2位叔醇羥基為該類化合物

4、產(chǎn)生活性所必須，但其究竟在藥物與靶酶活性位點(diǎn)的識(shí)別和定位中起何作用，目前還不清楚；分子結(jié)構(gòu)中3位側(cè)鏈部分是目前抗真菌藥優(yōu)化設(shè)計(jì)的主要部位，同時(shí)又發(fā)現(xiàn)其對(duì)藥物的抗真菌活性影響很大，這一效應(yīng)用國內(nèi)外建立的靶酶三維結(jié)構(gòu)都無法解釋其作用機(jī)理。因此，目前該類藥物分子作用機(jī)制研究亟待解決的主要問題是：氮唑類抗真菌藥物分子結(jié)構(gòu)中2位叔醇羥基和3位側(cè)鏈R與靶酶的作用模式。正確地闡明2位叔醇羥基和3位側(cè)鏈與靶酶作用模式，有可能給該類藥物創(chuàng)新設(shè)計(jì)帶來重大突

5、破。 本課題前期在CACYP51靶酶研究方面，在國內(nèi)外率先建立了一套集分子設(shè)計(jì)、化學(xué)合成和活性篩選三大系統(tǒng)為一體的抗真菌藥物計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)系統(tǒng)，成功地模建了白色念珠菌羊毛甾醇14α去甲基化酶的三維結(jié)構(gòu)，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行了作用活性位點(diǎn)的深入研究。研究中發(fā)現(xiàn)酶與底物的對(duì)接模型中Tyr118、Ser378、His310三個(gè)氨基酸殘基在靶酶與底物、靶酶與唑類衍生物側(cè)鏈 (2位叔醇羥基、3位側(cè)鏈)相互作用中起重要作用，并且與設(shè)計(jì)合成的C3

6、側(cè)鏈修飾的化合物有良好的選擇性。本課題既是為證明前期分子模型研究結(jié)果的合理性，以闡明以上的難題。為進(jìn)一步解釋Tyr118、Ser378、His310 在CACYP51 與不同唑類衍生物側(cè)鏈作用方式，進(jìn)行以下工作： 1.刪除酵母表達(dá)株內(nèi)源性ERG11基因 本研究為消除內(nèi)源基因的影響，刪除酵母基因工程菌Y12667中內(nèi)源性的CYP51基因。在基因DNA水平、蛋白水平驗(yàn)證了刪除的成功。并將外源基因轉(zhuǎn)入酵母刪除菌中，在生長和功能

7、水平證明了外源同源基因與內(nèi)源基因的互補(bǔ)性。確證內(nèi)源基因被成功刪除；外源基因能在基因刪除菌中正常表達(dá)；外源同源蛋白與內(nèi)源蛋白功能互補(bǔ)；建立了為下一步實(shí)驗(yàn)用的實(shí)驗(yàn)菌株。 2.完成CYP51蛋白殘基的突變、表達(dá)、定性及定量研究 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)突變體Y118A、Y118F、Y118T、S378A、S378T、H310A、H310R。并轉(zhuǎn)入基因刪除酵母菌中表達(dá)，獲取表達(dá)的微粒體蛋白。Western 鑒定顯示野生型及突變體蛋白表達(dá)成功。

8、突變點(diǎn)并未影響蛋白的抗原性。用分光光度法測定蛋白濃度，證明誘導(dǎo)表達(dá)量接近微粒體蛋白總量的25％。蛋白活性測定表明，表達(dá)的野生型蛋白有活性，對(duì)其天然底物的代謝能力為11.6nmol/min/mg pro，Y118(6.25/6.54/5.82nmol/min/mg)，H310(6.74/6.40 nmol/min/mg)的突變體蛋白活性有不同程度的改變，其中活性最多可下降1/2左右；而S378(8.22/8.05 nmol/min/mg)

9、的突變體蛋白活性變化較小。 3.整體水平表達(dá)蛋白的功能研究 分別測定不同突變衍生體蛋白對(duì)五個(gè)化合物：氟康唑、艾迪康唑、A1、A3、E2、E8的MIC80值和Spotting assay。與含野生型蛋白菌株相比，化合物對(duì)突變體菌株的抑制能力不同程度減弱。不同化合物對(duì)突變體的抑制效應(yīng)有差異，與氟康唑相比艾迪康唑、A系和E系化合物的體外抗菌效果強(qiáng)， Y118突變體對(duì)受試藥物艾迪康唑、A1、A3、E2、E8的敏感性較對(duì)氟康唑的作

10、用效應(yīng)明顯下降；378殘基對(duì)A3、E8化合物選擇性強(qiáng)于氟康嘩和艾迪康嘩。H310突變則負(fù)影響所有化合物的抗菌性能。但實(shí)驗(yàn)中該批A1、E2化合物測試穩(wěn)定稍差。因此，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)優(yōu)選了艾迪康唑、A3和E8作為受試藥，氟康唑?yàn)閷?duì)照藥。用GC-MS分析甾醇代謝成份，進(jìn)一步驗(yàn)證酶突變對(duì)細(xì)胞水平甾醇代謝的影響。生物活性以及化合物對(duì)靶酶突變衍生物的抑制效應(yīng)的量化驗(yàn)證方式是酶對(duì)底物的代謝能力測定。本研究中建立了以NADP發(fā)生系統(tǒng)為啟動(dòng)因子、GC-MS為測

11、定手段的酶活性和抑制劑的抑酶活性檢測實(shí)驗(yàn)，離體酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果(IC50)顯示Y118殘基對(duì)艾迪康唑和A,E系化合物的選擇性比氟康唑強(qiáng)10倍以上；S378對(duì)受試化合物的選擇性較Y118殘基弱，但也表現(xiàn)出對(duì)側(cè)鏈修飾中乙?；?、氰基和酰氨基集團(tuán)的偏好(A，E系化合物)。H310突變體對(duì)所有含叔醇羥基的化合物的敏感性明顯下降。拉曼光譜測定唑類衍生物側(cè)鏈與靶酶氨基酸殘基作用時(shí)的光學(xué)振動(dòng)位移結(jié)果顯示，與野生型游離酶蛋白比較、以及野生型酶蛋白與化合物復(fù)合物

12、的拉漫光譜比較，突變體酶與化合物的復(fù)合物拉曼振動(dòng)峰特征更接近野生型酶的非結(jié)合態(tài)，表明突變后化合物與酶的結(jié)合減少。結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持細(xì)胞水平和離體酶蛋白水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，所有的研究結(jié)果表明，Y118 的苯環(huán)側(cè)鏈與三唑醇類化合物的苯環(huán)的堆積作用影響酶與化合物的結(jié)合，影響化合物的抗菌活性；S378 殘基的羥基基團(tuán)與化合物的吸電子極性基團(tuán)形成的氫鍵參與化合物與酶的正確結(jié)合：H310 殘基與叔醇羥基的氫鍵作用是化合物抗菌活性發(fā)揮的重要