羽苔素E與唑類(lèi)藥物對(duì)耐藥白念珠菌的聯(lián)合作用及機(jī)制研究.pdf

1、近二十年來(lái)，深部真菌感染的發(fā)病率正在逐年上升。盡管致病性真菌種類(lèi)繁多，但白念珠菌仍然是院內(nèi)真菌感染最常見(jiàn)的致病性真菌，其系統(tǒng)性感染死亡率高，是引起癌癥患者和艾滋病患者死亡的主要原因。在抗真菌藥物中，氟康唑應(yīng)用最為廣泛，但是由于長(zhǎng)期大量使用，已產(chǎn)生了越來(lái)越多的氟康唑耐藥白念珠菌。而且，對(duì)氟康唑耐藥的臨床分離白念珠菌株通常對(duì)其他唑類(lèi)藥物也能夠產(chǎn)生交叉耐藥。針對(duì)上述問(wèn)題，藥物聯(lián)合應(yīng)用治療真菌感染的研究正在大量展開(kāi)，以期為真菌感染尋找可行的解決

2、方法。藥物聯(lián)用具備多種優(yōu)勢(shì)，如擴(kuò)大抗菌譜，提高抗菌效能，提高安全性與耐受性，不易誘發(fā)耐藥等。已報(bào)道的聯(lián)合用藥多局限在少數(shù)抗真菌藥物之間的合用，有些抗真菌藥物合用后反而會(huì)產(chǎn)生拮抗作用，并且針對(duì)氟康唑耐藥的臨床白念珠菌的聯(lián)合治療報(bào)道較少。 羽苔素E是從苔蘚類(lèi)植物地錢(qián)中提取的雙聯(lián)芐類(lèi)化合物，初步的抗菌活性篩選表明具有潛在的抗真菌活性，前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)對(duì)于氟康唑耐藥株，羽苔素E與氟康唑合用能明顯降低兩藥的用藥量，增加氟康唑在耐藥株細(xì)胞

3、內(nèi)的聚集，對(duì)耐藥株表現(xiàn)出協(xié)同的抗真菌作用。并且在高劑量(128μg/ml)下，羽苔素E可明顯抑制白念耐藥株主動(dòng)外排基因CDR1的表達(dá)水平。本課題研究羽苔素E與氟康唑、酮康唑、伊曲康唑和伏立康唑合用對(duì)臨床分離氟康唑耐藥白念珠菌的抗真菌作用，并對(duì)其逆轉(zhuǎn)機(jī)制作進(jìn)一步探討。 首先，采用NCCLS M-27A方案測(cè)定羽苔素E及氟康唑、酮康唑、伊曲康唑和伏立康唑的體外敏感性，結(jié)果顯示3株臨床分離氟康唑耐藥白念珠菌對(duì)其他三個(gè)唑類(lèi)藥物均顯示出抗

4、藥性，羽苔素E對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株的抗真菌活性與氟康唑相比較強(qiáng)。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)棋盤(pán)式微量稀釋法檢測(cè)了羽苔素E與氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、伏立康唑合用對(duì)上述3株白念珠菌的MIC值，計(jì)算其相應(yīng)的FICI指數(shù)，結(jié)果表明合用對(duì)3株菌均表現(xiàn)出協(xié)同作用(FIC≤0.5)。對(duì)于臨床耐藥白念珠菌CA10，時(shí)間-殺菌曲線實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，羽苔素E與四種不同唑類(lèi)聯(lián)合后，活菌濃度常用對(duì)數(shù)值比唑類(lèi)單用組均降低了≥21gCFU/ml，進(jìn)一步證實(shí)了兩藥的協(xié)同作用。并且體外實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)

5、果顯示兩藥合用對(duì)菌株生長(zhǎng)曲線的抑制作用具有羽苔素E劑量依賴(lài)性，當(dāng)氟康唑濃度為8μg/ml時(shí)，與三個(gè)不同濃度組羽苔素E合用后，其三個(gè)組的抑制作用差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 在此基礎(chǔ)上，觀察了羽苔素E對(duì)白念珠菌中若丹明6G泵出的影響。若丹明6G是白念珠菌細(xì)胞膜上能量依賴(lài)性ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物，對(duì)它的轉(zhuǎn)運(yùn)能力可以判斷外排泵蛋白的底物轉(zhuǎn)運(yùn)功能。羽苔素E對(duì)白念珠菌中若丹明6 G泵出實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8μg/ml的羽苔素E能夠顯著抑制若

6、丹明6G的泵出，并且隨著羽苔素E給藥濃度的提高，這種泵出抑制作用呈劑量依賴(lài)性增強(qiáng)。為了確定羽苔素E抑制若丹明6G泵出的機(jī)制是否是通過(guò)降低ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)錄水平而起作用，我們應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)了若丹明泵出過(guò)程中(即與白念珠菌作用100min時(shí))白念珠菌主動(dòng)外排基因CDRl、CDR2的表達(dá)水平，未發(fā)現(xiàn)對(duì)這兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄抑制作用。同時(shí)，菌株與若丹明6G和氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、伏立康唑共同孵育時(shí)，四種唑類(lèi)藥物均能引起若丹明6G的外排減少

7、，提示它們與若丹明6G存在共同的藥物結(jié)合位點(diǎn)。 既然羽苔素E抑制耐藥白念珠菌對(duì)若丹明6G的泵出不是依賴(lài)于外排基因的轉(zhuǎn)錄水平的提高，那么這種抑制作用的機(jī)制如何呢?我們進(jìn)一步應(yīng)用定磷法測(cè)定了羽苔素E對(duì)耐藥白念珠菌CA10質(zhì)膜ATPase活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)羽苔素E濃度為8μg/ml、16μg/ml和32μg/ml時(shí)均能夠抑制質(zhì)膜ATP酶活性，減少ATP水解，從而抑制外排蛋白的泵出功能；另外，采用高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)羽苔素E

8、對(duì)白念珠菌耐藥株中ATP泵出的影響，由于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)底物時(shí)會(huì)泵出一定比例的ATP，而當(dāng)羽苔素濃度為16μg/ml時(shí)，胞外的ATP濃度不僅未增高，反而明顯低于耐藥株空白組，結(jié)果間接提示羽苔素E可能不會(huì)被ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白泵出胞外，并且抑制了外排泵功能。 在若丹明6G的泵出實(shí)驗(yàn)中，觀察到羽苔素E與耐藥白念珠菌孵育100min對(duì)耐藥基因的mRNA.水平無(wú)明顯影響。我們進(jìn)一步采用RT-PCR法考察了低濃度羽苔素E(16μg/ml)與耐

9、藥白念珠菌孵育不同的時(shí)間后主動(dòng)外排基因CDRl和CDR2的表達(dá)水平。檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置了2h、6h和18h，結(jié)果顯示作用時(shí)間為6h和18h時(shí)，羽苔素E均能夠顯著降低CDRl和CDR2的表達(dá)水平，而作用2h時(shí)，結(jié)果同前，對(duì)這兩個(gè)基因的表達(dá)都無(wú)明顯抑制作用。由此可知，羽苔素E對(duì)基因表達(dá)水平的影響可能是在2～6h間開(kāi)始顯現(xiàn)。 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)羽苔素E與氟康唑、酮康唑、伊曲康唑和伏立康唑合用后，具有較強(qiáng)的協(xié)同抗耐藥白念珠菌作用，作用