熱帶念珠菌氟康唑耐藥機(jī)制及粉防己堿對(duì)其逆轉(zhuǎn)作用的研究.pdf

1、背景:
　　 隨著免疫缺陷人群的增多，侵襲性真菌感染的發(fā)病率不斷增高，在某些地區(qū)熱帶念珠菌已成為僅次于白念珠菌的第二位常見(jiàn)念珠菌。而近年來(lái)，熱帶念珠菌對(duì)常用抗真菌藥物氟康唑的耐藥率呈上升趨勢(shì)，耐藥性已成為影響臨床治療熱帶念珠菌感染療效的主要原因。因此，研究熱帶念珠菌耐藥性的形成機(jī)制和尋找逆轉(zhuǎn)其耐藥性的有效藥物是一項(xiàng)極其緊迫的課題。
　　 目的:
　　 探討臨床分離的熱帶念珠菌氟康唑耐藥性的機(jī)制及粉防己堿對(duì)其耐藥性

2、的逆轉(zhuǎn)作用，為尋找和研究氟康唑耐藥熱帶念珠菌的治療提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、收集太原市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室2010年1月—10月分離的200株念珠菌，并采用PCR-RFLP 技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定，即應(yīng)用真菌的通用引物對(duì)核糖體DNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列進(jìn)行擴(kuò)增，MspⅠ酶切其PCR 產(chǎn)物，以鑒定到種；
　　 2、運(yùn)用ATB FUNGUS 3 藥敏板條檢測(cè)41株熱帶念珠菌對(duì)常用抗真菌藥物的敏感性；

3、PCR 擴(kuò)增氟康唑耐藥菌株和敏感菌株靶酶基因ERG11基因并進(jìn)行測(cè)序分析；RT-PCR 檢測(cè)其靶酶基因ERG11和外排基因CDR1、MDR1mRNA表達(dá)情況；
　　 3、MTT 法測(cè)定TET對(duì)氟康唑耐藥熱帶念珠菌臨床分離菌株的最大非細(xì)胞毒性濃度，藥敏試驗(yàn)分析非細(xì)胞毒性劑量的粉防己堿對(duì)5株氟康唑耐藥熱帶念珠菌氟康唑MIC值的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其對(duì)熱帶念珠菌Rh123的蓄積能力的影響，RT-PCR分析粉防己堿作用前后，外排基因CD

4、R1、MDR1及靶酶基因ERG11mRNA的表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1、應(yīng)用PCR-RFLP 方法對(duì)200株臨床分離念珠株進(jìn)行鑒定，共分離出白色念珠菌128株（64.0％），熱帶念珠菌41株（20.5％），光滑念珠菌11株（5.5％），近平滑念珠菌13株（6.5％），克柔念珠菌7株（3.5％），與微生物自動(dòng)分析儀鑒定結(jié)果一致；
　　 2、41株熱帶念珠菌對(duì)5-氟胞嘧啶、兩性霉素B、氟康唑、伏立康唑和伊曲

5、康唑的耐藥率分別為2.4％、0％、12.2％、7.3％、26.8％；ERG11基因測(cè)序結(jié)果顯示，熱帶念珠菌氟康唑耐藥株ERG11基因共存在4 處錯(cuò)義突變（R245K兩處，Y221F、V362I 各一處），敏感菌株中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)錯(cuò)義突變；耐藥菌株的ERG11、CDR1和MDR1基因mRNA的表達(dá)量均高于敏感菌株；
　　 3、TET對(duì)熱帶念珠菌的最大非細(xì)胞毒性劑量濃度為20μg/ml；經(jīng)此濃度的TET作用后，氟康唑?qū)?株耐藥性熱帶念珠菌

6、的MIC的范圍由64-128μg/ml 減少到16-64μg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；粉防己堿作用組中，熱帶念珠菌對(duì)Rh123的蓄積量明顯高于對(duì)照組；RT-PCR 結(jié)果顯示，粉防己堿可以下調(diào)耐藥性熱帶念珠菌CDR1和MDR1基因mRNA水平的表達(dá)，但對(duì)ERG11基因的表達(dá)無(wú)明顯作用。
　　 結(jié)論:
　　 1、PCR-RFLP 技術(shù)是鑒定臨床常見(jiàn)念珠菌的有效手段，具有快速、準(zhǔn)確、特異性高等優(yōu)點(diǎn)；
　　 2、熱帶念珠