氟康唑和鈣通道阻滯劑聯(lián)合對(duì)抗耐藥白色念珠菌的作用及機(jī)制研究.pdf

1、近年來(lái)，侵襲性真菌感染在一些免疫力低下者的人群（如腫瘤患者，器官移植、導(dǎo)管插管患者及艾滋病患者等）中的發(fā)生率越來(lái)越高。這些臨床分離的侵襲性真菌中，念珠菌占有較高的比例，其中白色念珠菌引起的感染是念珠菌感染的主要組成部分。唑類抗真菌藥物尤其是氟康唑，憑借其安全、有效、價(jià)廉和低毒的特性成為預(yù)防和治療白色念珠菌所引起感染的首選藥。然而，隨著氟康唑在臨床治療中的頻繁使用，真菌的耐藥現(xiàn)象也隨之而來(lái)，給臨床治療深部真菌感染帶來(lái)極大的挑戰(zhàn)。
　

2、　研究一個(gè)新的抗菌藥物需要巨大的經(jīng)濟(jì)投入，強(qiáng)大的研究隊(duì)伍，而且將會(huì)耗時(shí)多年，因此，聯(lián)合用藥成為克服真菌耐藥的有效策略之一。近年來(lái)研究表明，許多非抗真菌藥物自身雖無(wú)強(qiáng)大的抗真菌作用，但能明顯增加唑類藥物的敏感性，這對(duì)于克服真菌耐藥性無(wú)疑是一種有效的途徑，也為新藥開發(fā)提供了新的線索與思路。唑類抗真菌藥物在臨床上治療深部侵襲性真菌病的應(yīng)用非常廣泛，如果能通過(guò)聯(lián)合用藥的途徑，從已用于臨床的非抗真菌藥物中篩選出能夠增加唑類抗真菌藥物敏感性的有效藥

3、物，這對(duì)于增加唑類這一安全、價(jià)廉的抗真菌藥物的臨床作用效果，意義重大。
　　鈣穩(wěn)態(tài)是白色念珠菌正常生長(zhǎng)的基礎(chǔ)，鈣離子不僅參與胞內(nèi)基礎(chǔ)代謝，還能維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等重要細(xì)胞器的生理功能，而且鈣離子還可作為一種多功能信號(hào)載體調(diào)節(jié)白色念珠菌細(xì)胞的多種活動(dòng)，包括形態(tài)發(fā)生、環(huán)境壓力應(yīng)答以及致病性等。鈣通道阻滯劑(Calcium channel blockers，CCBs)為臨床常用藥物，安全性好，近年來(lái)許多研究表明多種鈣通道阻滯劑單用或與

4、唑類抗真菌藥物聯(lián)合應(yīng)用均有明顯抗白色念珠菌作用，如硝苯地平和維拉帕米單用能夠抑制白念芽管形成，維拉帕米，硝苯地平和尼莫地平能增強(qiáng)酮康唑抗真菌作用，維拉帕米與氟康唑聯(lián)用在對(duì)抗白色念珠菌生物被膜方面也具有協(xié)同作用。由此可見，鈣通道阻滯劑在抗真菌領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景，若能進(jìn)一步將其抗真菌機(jī)制研究透徹，必然會(huì)為發(fā)展新的抗真菌方法提供重要思路。此外，我們觀察到，目前國(guó)內(nèi)外圍繞鈣通道阻滯劑的抗真菌實(shí)驗(yàn)研究雖然較多，但是對(duì)臨床常用的這幾種該通道阻滯

5、藥如氨氯地平，硝苯地平，貝尼地平和氟桂利嗪與氟康唑聯(lián)合抗真菌的作用卻沒有研究。本實(shí)驗(yàn)選取臨床常用的這四種鈣通道阻滯劑，觀察其與氟康唑的聯(lián)合抗白色念珠菌作用，發(fā)現(xiàn)該組合表現(xiàn)出強(qiáng)烈協(xié)同作用，因此又對(duì)兩類藥物的協(xié)同作用機(jī)制進(jìn)行了深入的探討與研究。若能將鈣通道阻滯劑與氟康唑藥物的協(xié)同抗耐藥白色念珠菌機(jī)制研究透徹，不僅能擴(kuò)大鈣通道阻滯劑的臨床應(yīng)用范圍，還將對(duì)抗真菌耐藥的研究產(chǎn)生重大的理論依據(jù)與現(xiàn)實(shí)意義。
　　1.氟康唑和鈣通道阻滯劑聯(lián)合抗白

6、念的作用研究
　　參照CLSI M27-A3方案中的棋盤法，用對(duì)倍稀釋的方法配制系列濃度的鈣通道阻滯劑（氨氯地平，硝苯地平，貝尼地平和氟桂利嗪）和氟康唑。分別吸取50微升的氟康唑和鈣通道阻滯劑類藥物加入96孔板各個(gè)孔內(nèi)，再往各含藥孔中分別加入提前配好的終濃度約為1×103 CFU/ml的白念，在35度恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h，用XTT-甲萘醌避光負(fù)載2h，用酶標(biāo)儀測(cè)OD值，以真菌生長(zhǎng)達(dá)到80％抑制時(shí)為判讀終點(diǎn)，用分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)

7、(FICI)法和非參數(shù)反應(yīng)面(△E)法分別評(píng)價(jià)藥物聯(lián)用結(jié)果。結(jié)果顯示氨氯地平，硝苯地平，貝尼地平和氟桂利嗪與氟康唑聯(lián)用對(duì)耐藥白念的FICI分別為0.017，0.019，0.035和0.033，均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.5，正負(fù)△E值相加之和遠(yuǎn)大于200％，證明這兩類藥物聯(lián)合對(duì)耐藥白念的顯著協(xié)同作用。但對(duì)敏感白念無(wú)協(xié)同作用。
　　于不同的EP管中分別加入CA10菌懸液，并加入一定濃度的不同藥物及組合，以XTT法分別測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)藥物作用的效果。

8、以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以所測(cè)OD值為縱坐標(biāo)，繪制不同藥物組合對(duì)CA10的時(shí)間殺菌曲線圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與生長(zhǎng)對(duì)照組相比，6h之后各含氟康唑的組開始出現(xiàn)生長(zhǎng)延遲，其中氟康唑和氨氯地平聯(lián)用組處理的真菌生長(zhǎng)延遲最明顯，再次驗(yàn)證了氨氯地平，硝苯地平，貝尼地平和氟桂利嗪與氟康唑的聯(lián)合抗耐藥白色念珠菌的協(xié)同作用。
　　2.氟康唑和鈣通道阻滯劑聯(lián)用對(duì)真菌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的影響
　　選取體外作用研究中與氟康唑協(xié)同效果最好鈣通道阻滯劑氨氯地平為主要受試藥。

9、于10ml無(wú)菌離心管中過(guò)夜培養(yǎng)一定濃度的CA10菌液，離心收集菌細(xì)胞，用不含鈣的D-Hanks緩沖液清洗三次，再用D-Hanks緩沖液重懸，濾過(guò)分散細(xì)胞（300目尼龍網(wǎng)），調(diào)節(jié)菌液濃度為1×107 CFU/ml，將調(diào)節(jié)后的菌液與終濃度為6μM的Fluo-3/AM在37℃下120rpm振蕩，避光負(fù)載50min，加入氨氯地平和氟康唑的單藥或組合藥后上機(jī)用流式細(xì)胞儀測(cè)各組胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，來(lái)反映細(xì)胞內(nèi)鈣濃度。
　　結(jié)果表明，和生長(zhǎng)對(duì)照組相比

10、，氨氯地平或氟康唑單用組中CA10細(xì)胞內(nèi)鈣離子幾乎無(wú)變化，兩種藥物聯(lián)用組中CA10細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度則有升高趨勢(shì)。由此可以推測(cè)，兩藥聯(lián)用對(duì)抗耐藥白色念珠菌的協(xié)同機(jī)制可能與真菌細(xì)胞內(nèi)鈣離子紊亂有關(guān)。
　　3.氟康唑和鈣通道阻滯劑聯(lián)用對(duì)白色念珠菌細(xì)胞內(nèi)鈣通道相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　為進(jìn)一步探討和研究?jī)伤幝?lián)用導(dǎo)致CA10細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高的原因，本實(shí)驗(yàn)仍是以鈣通道阻滯劑中的氨氯地平與氟康唑作為受試藥，用熱酚法提取兩藥單用或聯(lián)用處理后C

11、A10的總RNA，并設(shè)置不加藥的對(duì)照組。分別采用普通反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR)和實(shí)時(shí)定量PCR(Real Time-PCR，RT-PCR)的方法對(duì)鈣信號(hào)通路中編碼細(xì)胞膜上鈣通道的基因（CCH1，MID1），編碼鈣調(diào)磷酸酶的基因(CNA1，CNB1)和編碼液泡膜上介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)高濃度鈣進(jìn)入液泡內(nèi)的鈣通道基因（YVC1）的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，與對(duì)照組和單用組相比，兩藥聯(lián)用組對(duì)CCH1和MID1的表達(dá)

12、量無(wú)明顯影響，卻驚喜的發(fā)現(xiàn)聯(lián)用組和能引起CNA1，CNB1和YVC1基因表達(dá)量的降低，尤其是CNA1的基因表達(dá)量，降低量最為明顯。由此我們可以推測(cè)，氨氯地平和氟康唑聯(lián)合的協(xié)同作用機(jī)制可能與抑制了CNA1，CNB1，YVC1基因的表達(dá)有關(guān)。從而引起對(duì)鈣離子平衡調(diào)控起著重要作用的鈣調(diào)磷酸酶的功能和介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)高濃度鈣進(jìn)入液泡的鈣通道受抑，導(dǎo)致CA10細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的升高。
　　4.鈣通道阻滯劑對(duì)氟康唑的耐藥基因及蛋白的表達(dá)和功能的影響

13、r>　　由于藥物外排增加是白色念珠菌最常見的耐藥機(jī)制之一，本實(shí)驗(yàn)分別利用PCR技術(shù)和羅丹明6G外排實(shí)驗(yàn)從基因表達(dá)水平的變化和蛋白活性的變化兩個(gè)角度探究鈣通道阻滯劑氨氯地平等是否減弱了耐藥真菌對(duì)氟康唑的外排。通過(guò)熱酚法提取CA10的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用普通PCR和RT-PCR定性和定量測(cè)定的外排耐藥基因CDR1，CDR2和MDR1的表達(dá)變化。并利用羅丹明6G作為藥物外排的底物，探究鈣通道阻滯劑的加入是否抑制了真菌外排泵的活性。實(shí)

14、驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，氨氯地平和氟康唑單用或聯(lián)用對(duì)CDR1，CDR2和MDR1表達(dá)量的影響均無(wú)顯著差異。且羅丹明6G實(shí)驗(yàn)表明鈣通道阻滯劑的加入并不能影響藥物的外排泵的活性。由此我們推測(cè)，鈣通道阻滯劑和氟康唑聯(lián)合協(xié)同作用機(jī)制與減弱藥物外排無(wú)關(guān)。
　　綜上所有實(shí)驗(yàn)證明，氨氯地平，硝苯地平，貝尼地平和氟桂利嗪和氟康唑聯(lián)合抗白色念珠菌具有強(qiáng)協(xié)同作用。協(xié)同作用機(jī)制可能與抑制了真菌細(xì)胞內(nèi)編碼鈣調(diào)磷酸酶的基因（CNA1，CNB1）和編碼液泡