唑類(lèi)藥物與氟西汀聯(lián)合應(yīng)用通過(guò)減弱毒力因子逆轉(zhuǎn)白色念珠菌耐藥性的作用與機(jī)制研究.pdf

1、背景:近年來(lái)，由于廣譜抗生素、抗腫瘤藥物的大范圍應(yīng)用，放射治療和移植手術(shù)過(guò)程中的免疫抑制，免疫缺陷疾病患者尤其是艾滋病患者年增加等原因，白色念珠菌感染發(fā)生率不斷提高。以氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑?yàn)榇淼娜蝾?lèi)藥物是臨床應(yīng)用最廣泛的抗真菌藥。近年來(lái)，白色念珠菌對(duì)唑類(lèi)耐藥菌株的發(fā)生率不斷升高，因此臨床上迫切需要新的有效的治療方案。將效果逐年下降的抗真菌藥物與已獲得上市的非抗真菌藥聯(lián)合使用，可以在減少抗真菌藥劑量的同時(shí)發(fā)揮增效、減毒的作用。選

2、擇性五羥色胺再攝取抑制劑(selective serotoninreuptakeinhibitors，SSRIs)近年來(lái)被人們發(fā)現(xiàn)具有抗真菌活性，但目前針對(duì)SSRIs抗真菌活性的研究多集中在使用棋盤(pán)法簡(jiǎn)單測(cè)定MICs上，缺少動(dòng)態(tài)活性以及相關(guān)的體內(nèi)研究。而且，目前的研究都集中在對(duì)抗真菌作用的測(cè)定上，更進(jìn)一步深入的機(jī)制研究仍屬空白。若能透徹研究選擇性五羥色胺再攝取抑制劑與唑類(lèi)藥物的協(xié)同抗菌機(jī)制，可以對(duì)抗真菌耐藥現(xiàn)象產(chǎn)生重大的理論和現(xiàn)實(shí)應(yīng)用意

3、義。
　　目的:本課題評(píng)價(jià)唑類(lèi)藥物與氟西汀聯(lián)合對(duì)耐藥的念珠菌的體外靜態(tài)及動(dòng)態(tài)抗真菌作用，建立大蠟螟感染模型評(píng)價(jià)體內(nèi)抗真菌作用，并探索可能的協(xié)同作用機(jī)制。
　　方法:選擇白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌等11株耐藥念珠菌。參照CLSI M27-A3方法中的棋盤(pán)法測(cè)定最小抑菌濃度，以真菌生長(zhǎng)與對(duì)照孔相比80％抑制為判斷重點(diǎn)，用生長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)差值模型(△E)和分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)法(FICI)評(píng)價(jià)藥物聯(lián)用的效果。對(duì)于聯(lián)合作用

4、的動(dòng)態(tài)評(píng)價(jià)，在藥物干預(yù)后的0，12，24，36和48h使用XTT法測(cè)定各孔的OD值。用藥物作用時(shí)間為x-軸，OD值為y-軸繪制時(shí)間-殺菌曲線(xiàn)。最后，選擇氟西汀和氟康唑作為實(shí)驗(yàn)藥物，測(cè)定兩藥聯(lián)合對(duì)耐藥白色念珠菌的生物膜的作用，分別在0，4，8，12，24和48h測(cè)定生長(zhǎng)率。之后，本課題使用大蠟螟建立白色念珠菌感染模型，分別以生存率、體內(nèi)真菌清除率和組織病理切片三個(gè)方面評(píng)價(jià)藥物聯(lián)用對(duì)白色念珠菌的體內(nèi)作用。藥物聯(lián)用協(xié)同抗真菌的機(jī)制研究包括:使

5、用卵黃瓊脂培養(yǎng)基體外測(cè)定氟康唑濃度固定的情況下，氟西汀對(duì)白色念珠菌的胞外磷脂酶活性的影響;使用實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定分泌型天冬氨酸蛋白酶編碼基因SAP1，SAP2，SAP3，SAP4在不同藥物干預(yù)后的相對(duì)表達(dá)量。
　　結(jié)果:氟西汀與氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑聯(lián)用對(duì)耐藥白色念珠菌的FICI值＜0.5，△E加和＞200％，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的協(xié)同作用。對(duì)耐藥非白色念珠菌的FICI值在0.5-1.5之間，表現(xiàn)為無(wú)關(guān)作用。時(shí)間-殺菌曲線(xiàn)法進(jìn)一步證實(shí)。

6、在加入藥物后不同的時(shí)間點(diǎn)，藥物聯(lián)用可明顯抑制真菌生長(zhǎng)，并持續(xù)較長(zhǎng)的作用時(shí)間。這一結(jié)果與棋盤(pán)法實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。微量稀釋法發(fā)現(xiàn)，氟康唑和氟西汀聯(lián)用在24小時(shí)內(nèi)(4，8，12h)對(duì)白色念珠菌生物膜表現(xiàn)出協(xié)同抗真菌作用，但作用弱于對(duì)抗浮游菌。該協(xié)同作用隨生物膜生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減弱。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分發(fā)現(xiàn)，氟康唑與氟西汀聯(lián)用時(shí)，大蠟螟的生存率高于對(duì)照組和氟康唑單用組的大蠟螟，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。當(dāng)氟康唑與氟西汀聯(lián)用后，24小時(shí)后大蠟螟

7、體內(nèi)的真菌數(shù)僅為注射量的1/5。隨時(shí)間延長(zhǎng)，藥物聯(lián)用組的真菌數(shù)雖有上升，仍顯著低于對(duì)照組和FLC單用組。另外，病理組織切片的染色標(biāo)本同樣可以看到，感染后使用氟西汀與氟康唑聯(lián)合干預(yù)，可以抑制白色念珠菌在大蠟螟體內(nèi)形成菌絲，減輕組織破壞程度。對(duì)藥物聯(lián)用的協(xié)同作用機(jī)制研究中，分泌型天冬氨酸蛋白酶的編碼基因SAP1-SAP4均在加入FLC與FLUO后表達(dá)量顯著下降，其中，SAP4最為顯著，表達(dá)量是FLC單用組的1/8。另外，雖然白色念珠菌的細(xì)胞

8、外磷脂酶活性似乎不受到低濃度FLUO的影響，但當(dāng)FLUO濃度上升至64μg/ml及以上時(shí)，磷脂酶活性急劇下降，幾乎看不到抑菌圈。
　　結(jié)論:唑類(lèi)藥物與選擇性五羥色胺再攝取抑制劑氟西汀聯(lián)用在體內(nèi)和體外均對(duì)耐藥白色念珠菌表現(xiàn)出協(xié)同作用，并對(duì)白色念珠菌生物膜同樣有效。兩藥協(xié)同抗白色念珠菌的作用機(jī)制與減少分泌型天冬氨酸蛋白酶編碼基因SAP1，SAP2，SAP3，SAP4的表達(dá)和抑制白色念珠菌胞外磷脂酶活性有關(guān)。本課題的研究發(fā)現(xiàn)為抗真菌藥物