MDR1基因與白色念珠菌毒力相關(guān)性及藥物聯(lián)用治療感染小鼠的研究.pdf

1、目的:
　　耐藥白色念珠菌的治療一直是臨床關(guān)注的問題，耐藥白色念珠菌多藥耐藥基因MDR1的高表達(dá)是否引起毒力變化，也是有爭(zhēng)議的話題。利用MDR1基因高表達(dá)的耐藥白色念珠菌CaR建立彌散性感染小鼠模型。在此基礎(chǔ)上，利用基因工程改造菌株CaDEL（MDR1基因敲除菌株）、CaCOM-A（MDR1敲入菌株）、CaCOM-B（MDR1敲入菌株）感染小鼠，進(jìn)行MDR1基因與白色念珠菌毒力相關(guān)性研究，探討MDR1高表達(dá)是否對(duì)毒力有影響。同時(shí)，

2、開展抗耐藥真菌藥物的篩選，建立藥物的體內(nèi)篩選系統(tǒng)。
　　方法：
　　將耐藥白色念珠菌CaR尾靜脈接種免疫抑制ICR小鼠，建立彌散性感染小鼠模型，評(píng)價(jià)感染小鼠的生存狀況和平均生存時(shí)間；采集感染小鼠的腎、心、腦、肺、脾、肝組織進(jìn)行組織載菌量檢測(cè)和病理診斷；利用流式微球分析技術(shù)（CBA）檢測(cè)血液和腎組織的細(xì)胞因子IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL12p70、IL-15、IL-17、TN

3、F-α、IFN-γ、GM-CSF的變化；在此基礎(chǔ)上，利用基因工程改造菌株CaDEL、CaCOM-A、CaCOM-B感染小鼠，評(píng)價(jià)MDR1基因?qū)π∈蠖玖Φ挠绊懀约皺z測(cè)感染腎組織白色念珠菌的AFT2、CEK1、CPH1、CPP1、EFG1、FLO86個(gè)菌絲相關(guān)毒力因子和ALS1、ALS5、HGC1、HWP1、INT1、MNT1、PMT1、PMT6、TCC1、TEC1、TPK2、TUP112個(gè)粘附相關(guān)毒力因子的變化；并利用建立的耐藥白色念珠

4、菌彌散性感染小鼠模型，口服給予氟康唑、原黃素、聯(lián)合藥物，進(jìn)行模型應(yīng)用評(píng)價(jià)研究。
　　結(jié)果：
　　1.建立耐藥白色念珠菌彌散性感染小鼠模型
　　CY免疫抑制ICR小鼠接種1.0×105CFU CaR，14天內(nèi)死亡率約為90％。臨床表現(xiàn)：虛弱，立毛，眼部出現(xiàn)分泌物，打轉(zhuǎn)，偏頭癥狀、死亡。解剖顯示：腎組織腫大，出現(xiàn)白色斑點(diǎn)，腦組織表面散布出血點(diǎn)。載菌量檢測(cè)：腎、心、腦、肺、脾、肝組織都檢出白色念珠菌，腎的載菌量最高，其次是心

5、、腦、肺、脾、肝；隨著感染時(shí)間的推移，各組織中的載菌量數(shù)逐漸減少；組織病理診斷：HE染色可見組織炎性細(xì)胞浸潤，其中，腎組織可見真菌性肉芽腫病理變化；PAS染色可見白色念珠菌分布在各組織中。細(xì)胞因子檢測(cè)：感染小鼠顯示急性非特異性炎癥反應(yīng)。血液中IL-6、TNF-α、IFN-γ和IL-1β與對(duì)照組相比出現(xiàn)明顯升高，其它細(xì)胞因子未見明顯變化；腎組織細(xì)胞因子與對(duì)照組相比，IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-15、IL-17、TNF-α、IF

6、N-γ、GM-CSF含量升高，IL-4、IL-10含量降低。
　　2.評(píng)價(jià)MDR1基因高表達(dá)對(duì)白色念珠菌毒力的影響
　　與MDR1基因相關(guān)的四種白色念珠菌CaR、CaDEL、CaCOM-A、CaCOM-B分別感染免疫抑制的ICR小鼠，均顯示典型的彌散性白色念珠菌感染，感染動(dòng)物14天內(nèi)死亡率約為90%，四組感染動(dòng)物之間生存無顯著性差異。感染第6天小鼠相關(guān)檢測(cè)結(jié)果顯示：腎、心、腦、肺、脾、肝組織載菌量無顯著性差異；組織病理診斷也

7、無顯著差異；細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示CaDEL組與其他組相比，血液中IL-6、IL-10、TNF-α升高，腎組織中IL-1α和TNF-α升高，IL-4、IL-5、IL-6、IL-15、IL-17降低，但是這些差異性并未影響毒力；毒力因子檢測(cè)結(jié)果顯示，CaR與CaDEL相比，相關(guān)毒力因子均表現(xiàn)顯著性差異，然而CaCOM-A、CaCOM-B與CaDEL相比，無顯著性差異。雖然MDR1高表達(dá)野生菌株CaR中檢測(cè)到12種毒力基因的表達(dá)升高，但是通過

8、敲入方式獲得的MDR1基因高表達(dá)的CaCOM-A、CaCOM-B菌株未顯示毒力基因表達(dá)差異性，因此，單一MDR1基因的高表達(dá)不能引起菌株毒力變化。
　　3.評(píng)價(jià)藥物在耐藥白色念珠菌感染模型上的應(yīng)用
　　利用耐藥白色念珠菌彌散性感染小鼠模型，開展原黃素、氟康唑及聯(lián)合用藥評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示原黃素治療感染小鼠無效，8mg/kg為氟康唑治療感染小鼠的有效劑量，100mg/kg原黃素或2mg/kg氟康唑和16mg/kg原黃素聯(lián)用未見明顯藥

9、效。
　　結(jié)論：
　　1.成功建立了耐藥白色念珠菌彌散性感染小鼠模型，并提供了動(dòng)物生存、組織載菌量、組織病理、細(xì)胞因子等指標(biāo)。
　　2.CaR、CaDEL、CaCOM-A、CaCOM-B感染小鼠相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)顯示 MDR1基因單一高表達(dá)不影響白色念珠菌毒力。
　　3.8mg/kg氟康唑能有效改善耐藥白色念珠菌感染小鼠的生存，100mg/kg原黃素或2mg/kg氟康唑和16mg/kg原黃素聯(lián)用都不能有效改善感染小鼠的