氟康唑與他克莫司聯(lián)合抗非白色念珠菌的作用與機(jī)制研究.pdf

1、背景:近年來，非白色念珠菌由于其較高的臨床分離率和對氟康唑具有較高的獲得耐藥性或固有耐藥性，越來越引起人們的關(guān)注和重視。在臨床常見非白色念珠菌中，光滑念珠菌是第二位人類最常見的病原菌，具有較高的獲得耐藥性;克柔念珠菌雖然檢出率不高，但對氟康唑天然耐藥。它們較高的耐藥性給臨床成功治療非白色念珠菌感染帶來了挑戰(zhàn)。綜合考慮臨床常見非白色念珠菌的檢出率和耐藥性，本課題選擇光滑念珠菌和克柔念珠菌作為研究對象?？拐婢幬锲贩N有限，而開發(fā)一種新的抗真

2、菌藥物耗時耗資巨大。因此，為應(yīng)對真菌不斷增加的耐藥性，越來越多的研究者關(guān)注于抗真菌藥物和非抗真菌藥物的聯(lián)合治療。他克莫司經(jīng)常用于器官移植患者的免疫抑制治療，而這些病人更容易遭受真菌感染。前期研究表明氟康唑和他克莫司聯(lián)用對耐藥的白色念珠菌有強(qiáng)大的協(xié)同作用，二者聯(lián)用對光滑念珠菌和克柔念珠菌是否也有協(xié)同作用值得研究。
　　目的:本研究旨在評價氟康唑和他克莫司聯(lián)合對不同敏感性的光滑念珠菌和克柔念珠菌的體外靜態(tài)和動態(tài)抗真菌作用，并探索其協(xié)同

3、作用可能的機(jī)制。
　　方法:分別采用棋盤法和時間-殺菌曲線法研究氟康唑和他克莫司聯(lián)用對不同敏感性的光滑念珠菌和克柔念珠菌的體外靜態(tài)和動態(tài)抗真菌作用。根據(jù)M27-A3抗真菌藥物敏感性測定方案，以XTT法測定兩藥聯(lián)合作用24h和48h時對不同敏感性分離株的MIC值，以部分抑菌濃度指數(shù)(FICI)評價兩藥聯(lián)合作用效果;對于動態(tài)聯(lián)合作用評價，分別在藥物干預(yù)后的0，6，12，24和48h采用菌落計數(shù)法進(jìn)行菌落計數(shù)，然后用藥物干預(yù)時間作橫坐標(biāo)

4、、每毫升菌液菌落數(shù)的常用對數(shù)值作縱坐標(biāo)描繪不同藥物處理后的時間-殺菌曲線。藥物聯(lián)合抗真菌作用機(jī)制研究包括:加入鈣通道抑制劑貝尼地平，以平板劃線法直觀評價抑制鈣通道對兩藥聯(lián)合抗真菌作用的影響;以實時定量PCR法測定氟康唑耐藥基因ERG11，CDR1，PDH1和SNQ2在不同藥物干預(yù)后的相對表達(dá)量;用羅丹明6G作熒光染色劑，以流式細(xì)胞術(shù)評價他克莫司對真菌泵出氟康唑的影響。
　　結(jié)果:他克莫司增加了劑量依賴性敏感(MIC=32μg/mL

5、)以及耐藥的光滑念珠菌和全部克柔念珠菌對氟康唑的敏感性，但菌株的敏感性不同，MIC值降低的程度也不同。對于MIC值大于等于256μg/mL的光滑念珠菌和克柔念珠菌菌株，他克莫司的加入使得氟康唑的MIC值降為原來的1/16，F(xiàn)ICI值小于0.1;對于MIC值為32μg/mL的光滑念珠菌和克柔念珠菌菌株，他克莫司的加入使氟康唑的MIC值變?yōu)樵瓉淼?/4，F(xiàn)ICI值約等于0.25;然而對于MIC值為8μg/mL的光滑念珠菌菌株，他克莫司的加入

6、并沒有降低氟康唑的MIC值。動態(tài)抗真菌作用實驗結(jié)果進(jìn)一步證明了兩藥的協(xié)同作用:與氟康唑單用組相比，兩藥聯(lián)合對光滑念珠菌和克柔念珠菌在24h時每毫升菌液CFU的常用對數(shù)值分別下降了2.31和2.25個單位。另外，以平板劃線法觀察菌株在藥物作用后的生長情況，結(jié)果表明貝尼地平的加入增加了兩藥聯(lián)合抗光滑念珠菌和克柔念珠菌的作用。對光滑念珠菌進(jìn)一步的機(jī)制研究表明氟康唑和他克莫司聯(lián)用顯著降低了ERG11和SNQ2基因的表達(dá)水平（表達(dá)量分別減少了90

7、％和66％），顯著增加了CDR1基因的表達(dá)，對PDH1基因的表達(dá)無顯著影響。流式細(xì)胞術(shù)的分析結(jié)果表明他克莫司抑制了氟康唑的外排，特別是在加入他克莫司作用40分鐘后抑制作用最明顯（胞內(nèi)熒光強(qiáng)度是對照組的2.76倍）。
　　結(jié)論:氟康唑和他克莫司聯(lián)用對光滑念珠菌和克柔念珠菌展現(xiàn)出協(xié)同作用。抑制鈣離子通道能夠增強(qiáng)兩藥協(xié)同抗真菌作用，說明兩藥協(xié)同抗真菌作用與鈣調(diào)節(jié)有關(guān);兩藥協(xié)同抗光滑念珠菌的作用機(jī)制與減少了ERG11和SNQ2基因的表達(dá)和