小鼠肝癌多藥耐藥模型的建立及鹽酸千金藤堿對其逆轉(zhuǎn)作用的研究.pdf

1、目的：惡性腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生的多藥耐藥性(multidrug resistance,MDR)是腫瘤細(xì)胞免受化療藥物攻擊的最重要的細(xì)胞預(yù)防機(jī)制,是導(dǎo)致化療失敗的主要原因。對于MDR產(chǎn)生機(jī)制和逆轉(zhuǎn)劑的研究,目前多采用多藥耐藥細(xì)胞系作體外研究或接種裸鼠體內(nèi)的研究方法,從某種程度上難以模擬惡性腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)受到化療藥物的干預(yù)產(chǎn)生的MDR。為克服MDR需尋找有效的逆轉(zhuǎn)劑,目前研究證實(shí)多數(shù)逆轉(zhuǎn)劑如維拉帕米和環(huán)孢素A應(yīng)用于體內(nèi)會產(chǎn)生很大的毒性而限

2、制其臨床應(yīng)用;因此開發(fā)高效、低毒、價廉的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑刻不容緩。鹽酸千金藤堿(cepharanthine hydrochloride,CH)具有多種生物學(xué)活性,近年國外文獻(xiàn)表明其有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的作用。本課題組應(yīng)用臨床治療肝癌聯(lián)合化療FAP方案及采用細(xì)胞和分子生物學(xué)的檢測方法,建立獲得性KM小鼠腹水型肝癌(Hca/FAP)MDR體內(nèi)模型且深入探討產(chǎn)生的分子機(jī)制;同時進(jìn)一步研究CH對KM小鼠腹水型Hca/FAP模型的逆轉(zhuǎn)作用及機(jī)制,為C

3、H將用于臨床肝癌耐藥的逆轉(zhuǎn)提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：實(shí)驗(yàn)采用臨床治療肝癌的聯(lián)合化療FAP方案(5-氟脲嘧啶+多柔比星+順鉑),按濃度梯度遞增法誘導(dǎo)KM小鼠肝癌Hca,建立獲得性Hca/FAP MDR模型。采用MTT法檢測Hca/FAP瘤細(xì)胞對7種化療藥物的耐藥譜及耐藥倍數(shù);應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測Hca、Hca/FAP瘤細(xì)胞對羅丹明123(Rhodamine123,Rh123)蓄積與泵出作用;使用RT-PCR技術(shù)檢測Hca、Hca/FA

4、P瘤細(xì)胞多藥耐藥基因(mdr1)、多藥耐藥相關(guān)蛋白基因(mrp1)mRNA的表達(dá)水平及撤藥后Hca/FAP瘤細(xì)胞mdr1、mrp1 mRNA的表達(dá)考察模型穩(wěn)定性。進(jìn)一步研究CH對Hca/FAP瘤細(xì)胞多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用。采用流式細(xì)胞儀檢測CH對Hca/FAP瘤細(xì)胞Rh123蓄積與泵出的影響;應(yīng)用CH聯(lián)合FAP化療方案治療Hca/FAP MDR小鼠,計(jì)算生命延長率評價其療效、流式細(xì)胞術(shù)PI染色檢測對凋亡的影響、RT-PCR技術(shù)檢測mdr1

5、、mrp1 mRNA表達(dá)水平是否改變。通過上述實(shí)驗(yàn)闡明Hca/FAP MDR產(chǎn)生機(jī)制及CH逆轉(zhuǎn)Hca/FAP MDR的作用和機(jī)制。 結(jié)果：1.MTT法檢測Hca/FAP瘤細(xì)胞耐藥譜及耐藥倍數(shù)Hca/FAP瘤細(xì)胞對誘導(dǎo)耐藥的FAP化療方案三種藥物即多柔比星(Adriamycin,ADR)、順鉑(Cisplatin,CDDP)、5-氟脲嘧啶(5-Flurouracil,5-Fu)耐藥倍數(shù)較高,分別為21.45、19.80、8.15倍;

6、且對柔紅霉素(Daunomycin,DNR)、依托泊苷(Etoposide,VP-16)、絲裂霉素(Mitomycin,MMC)、長春新堿(Vincristine,VCR)亦有一定程度的耐藥性,耐藥倍數(shù)分別為3.83、2.85、3.48、1.60倍;試驗(yàn)藥物對Hca、Hca/FAP瘤細(xì)胞的IC50兩者相比經(jīng)統(tǒng)計(jì)差異有顯著性(P<0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明其對蒽環(huán)類抗生素、長春花堿類、鬼臼乙叉甙、MMC和鉑類抗腫瘤藥物有交叉耐藥性;表明小鼠

7、肝癌Hca具有多藥耐藥表型。2.流式細(xì)胞術(shù)檢測Hca、Hca/FAP瘤細(xì)胞對Rh123蓄積與泵出作用Rh123的蓄積試驗(yàn):Hca瘤細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度(mean of fluorescence intensity,MFI)為204.3±11.2;Hca/FAP瘤細(xì)胞MFI為158.5±6.7,直方圖明顯左移,MFI值比Hca瘤細(xì)胞顯著減少,兩者間統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(P<0.01);Rh123的泵出試驗(yàn):Hca/FAP瘤細(xì)胞泵出率為68.2±

8、0.6％,而Hca瘤細(xì)胞泵出率為37.2±0.5％,藥物外排顯著增加,直方圖顯著左移且低平,兩者相比經(jīng)統(tǒng)計(jì)有顯著性差異(P<0.01);Rh123蓄積與泵出試驗(yàn)表明Hca/FAP瘤細(xì)胞多藥耐藥性產(chǎn)生機(jī)制之一是通過影響P-糖蛋白的功能,使細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積減少,泵出加快。3.RT-PCR檢測Hca、Hca/FAP mdr1、mrp1 mRNA的表達(dá)水平Hca/FAP瘤細(xì)胞mdr1、mrp1 mRNA電泳圖灰度比值分別為0.4192±0.046

9、8、0.7882±0.3171與Hca瘤細(xì)胞的灰度比值0.0480±0.0076、0.1953±0.0568相比,mdr1mRNA表達(dá)顯著增加,統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(P<0.01);且mrp1表達(dá)明顯增加,經(jīng)統(tǒng)計(jì)有明顯差異(P<0.05);說明Hca/FAP多藥耐藥模型誘導(dǎo)成功,產(chǎn)生機(jī)制可能與mdr1、mrp1 mRNA過度表達(dá)有關(guān)。4.RT-PCR法考察Hca/FAP多藥耐藥模型穩(wěn)定性Hca/FAP瘤細(xì)胞0周、4周、8周的mdr1 mR

10、NA電泳圖灰度比值為0.6874±0.0427、0.5615±0.0837、0.4097±0.0841;mrp1 mRNA電泳圖灰度比值為1.1276±0.3256、0.7639±0.1612、0.1232±0.0253;統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示撤藥4周Hca/FAP瘤細(xì)胞mdr1、mrp1mRNA表達(dá)與0周相比P>0.05,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;而撤藥8周mdr1、mrp1mRNA表達(dá)與0周相比P<0.01,統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異;說明撤藥4周Hca/FA

11、P瘤細(xì)胞多藥耐藥性保持較穩(wěn)定,而撤藥8周多藥耐藥性逐漸降低。5.流式細(xì)胞儀檢測CH對Hca/FAP瘤細(xì)胞Rh123蓄積與泵出的影響Rh123蓄積試驗(yàn):維拉帕米(Verapamil,VER)4μmol·L-1、CH8μmol·L-1、4μmol·L-1、2μmol·L-1于各檢測點(diǎn)與對照組MFI相比均能增加Hca/FAP瘤細(xì)胞對Rh123的蓄積,統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(P<0.01)。其中CH8μmol·L-1、4μmol·L-1與VER4μ

12、mol·L-1相比統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(P<0.01);結(jié)果表明CH、VER均能增加藥物在Hca/FAP瘤細(xì)胞內(nèi)的蓄積,CH8μmol·L-1、4μmol·L-1作用優(yōu)于VER4μmol·L-1。Rh123泵出試驗(yàn):CH8μmol·L-1、4μmol·L-1于各檢測點(diǎn)與對照組MFI相比統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(P<0.01);而VER4μmol·L-1和CH2μmol·L-1在60min、120min時,與對照組相比經(jīng)統(tǒng)計(jì)有顯著性差異(P<0.

13、01);CH8μmol·L-1與VER4μmol·L-1相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);結(jié)果表明CH能減少Hca/FAP瘤細(xì)胞對Rh123的泵出,增加細(xì)胞內(nèi)藥物濃度;其中CH8μmol·L-1與VER4μmol·L-1相比起效時間早,但作用相當(dāng);6.計(jì)算生命延長率評價CH聯(lián)合FAP化療方案對Hca/FAP MDR模型的逆轉(zhuǎn)作用VER、CH聯(lián)合FAP化療方案對Hca/FAP瘤細(xì)胞有一定的抑制作用:FAP+VER2.5mg·kg-1、CH

14、5mg·kg-1、CH2.5mg·kg-1組均可明顯延長Hca/FAP MDR小鼠的生存時間,生存天數(shù)為26.38±7.31、26.44±9.37、27.25±8.53,生命延長率達(dá)到了45.18％、45.51％、49.97％,與生理鹽水(NS)組(18.17±5.42天)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),三組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);單用FAP、CH5mg·kg-1、2.5mg·kg-1組與NS組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05

15、);表明VER、CH聯(lián)合FAP化療方案可延長Hca/FAP MDR小鼠的生存時間,CH與VER的作用相當(dāng)。7.RT-PCR技術(shù)檢測CH聯(lián)合FAP化療方案對Hca/FAP瘤細(xì)胞mdr1、mrp1 mRNA表達(dá)水平的影響FAP聯(lián)合VER2.5mg·kg-1、CH5mg·kg-1、2.5mg·kg-1均可明顯降低Hca/FAP瘤細(xì)胞mdr1mRNA的表達(dá),電泳圖灰度比值分別為0.4093±0.1570、0.3733±0.2317、0.4318

16、±0.5324,與NS組(0.7835±0.3027)相比經(jīng)統(tǒng)計(jì)有明顯差異(P<0.05),而三組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);單用FAP、CH5mg·kg-1、2.5mg·kg-1組mdr1 mRNA的表達(dá)水平與NS組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);對mrp1mRNA的表達(dá),用藥各組與NS組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);結(jié)果說明VER、CH聯(lián)合FAP化療方案可下調(diào)mdr1 mRNA的過度表達(dá),而對mrp1 mRNA的表達(dá)無

17、明顯影響。8.流式細(xì)胞術(shù)PI染色檢測CH聯(lián)合FAP化療方案對Hca/FAP瘤細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)PI染色結(jié)果顯示,流式細(xì)胞直方圖上出現(xiàn)了亞G1峰,Hca/FAP瘤細(xì)胞的自然凋亡率為3.8％,FAP、CH5mg·kg-1、2.5mg·kg-1組細(xì)胞凋亡率分別為6.13±0.56％、4.65±0.90％、3.75±0.75％,與NS組(3.80±0.24％)相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),而FAP聯(lián)合VER2.5mg·kg-1、CH5

18、mg·kg-1、2.5mg·kg-1給藥后,細(xì)胞凋亡率有不同程度的升高,分別為17.91±2.81％、20.41±1.69％、15.05±1.05％,與NS組相比經(jīng)統(tǒng)計(jì)有明顯差異(P<0.05);結(jié)果表明VER、CH聯(lián)合FAP化療方案能誘導(dǎo)Hca/FAP瘤細(xì)胞的凋亡;
　　結(jié)論：1.采用FAP方案對Hca長期誘導(dǎo)致使其產(chǎn)生MDR,Hca/FAP瘤細(xì)胞對蒽環(huán)類、長春花堿類、鬼臼乙叉甙、MMC和鉑類抗腫瘤藥物有不同程度的交叉耐藥性。2

19、.Hca/FAP耐藥性產(chǎn)生機(jī)制與mdr1、mrp1 mRNA過度表達(dá)和影響P-糖蛋白的功能,使細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積減少有關(guān)。3.Hca/FAP多藥耐藥模型保持具有藥物依賴性。隨著停藥時間延長,mdr1、mrp1 mRNA表達(dá)降低,獲得性多藥耐藥性逐漸消失。4.CH能通過影響P-gp的攝入和泵出功能而增加Hca/FAP瘤細(xì)胞內(nèi)藥物濃度,減少藥物的外排;且有濃度依賴性,其中CH8μmol·L-1作用優(yōu)于VER。5.CH能增強(qiáng)抗腫瘤藥物的作用,逆轉(zhuǎn)