鹽酸千金藤堿對人卵巢癌的作用及其機制的研究.pdf

1、卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤，由于早期很難發(fā)現(xiàn)，患者因出現(xiàn)臨床癥狀而就診時，往往腫瘤已對周圍組織器官造成侵襲，出現(xiàn)盆、腹腔內(nèi)的浸潤與轉(zhuǎn)移?；熓锹殉舶┑闹匾委熓侄危殉舶┑呐R床化療方案以鉑類和紫杉醇為主導(dǎo)，化療初始時約有80％的患者顯示治療有效，然而多數(shù)患者很快就會因腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)的出現(xiàn)而使治療效果受到嚴重影響。
　　卵巢癌易于侵襲轉(zhuǎn)移和易于產(chǎn)生MDR的特點，使其成為臨床上預(yù)

2、后最差的婦科腫瘤，在充分治療的情況下，五年生存率仍低于45％，因此，研發(fā)、尋找更為有效的治療藥物，尤其是尋找在抑制腫瘤生長的同時，還能抑制腫瘤侵襲或逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的藥物，對卵巢癌的治療具有重大意義。
　　本室參與研制的鹽酸千金藤堿(cepharanthine hydrochloride，CH)，是經(jīng)由千金藤屬植物頭花千金藤中提取的千金藤素(cepharanthine，CEP)鹽化而得到的半合成化合物。多個研究證明，CEP在某些類型

3、的腫瘤中可以表現(xiàn)出直接的抗腫瘤活性，也可以抑制某些腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，另外有研究證實CEP可以有效地增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，而CEP或CH對卵巢癌相關(guān)方面的作用在國內(nèi)外尚未見報道。
　　為了探索CH對卵巢癌的作用，選取上皮來源的卵巢癌耐紫杉醇且具有MDR表型的A2780/Taxol細胞株和其親本的A2780細胞株為模型，采用多種實驗技術(shù)研究了CH對卵巢癌的增殖、凋亡、遷移和多藥耐藥性的影響及其作用機制，以求擴大CH可能的

4、臨床適應(yīng)證，為其進一步開發(fā)提供理論和實驗依據(jù)。根據(jù)涉及內(nèi)容的相關(guān)性，本研究可以分成以下兩個部分:
　　第一部分 鹽酸千金藤堿對卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其機制的研究
　　目的:
　　本部分以卵巢癌A2780細胞為受試對象，旨在研究CH對A2780細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響及其相關(guān)機制。
　　方法:
　　采用MTT法檢測不同濃度的CH作用于A2780細胞72h的增殖抑制率，并求得IC50;采用M

5、TT法檢測以IC50濃度的CH作用于A2780細胞24h、48h、72h和96h的增殖抑制率;采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法，通過流式細胞儀檢測CH對A2780細胞凋亡的影響;采用劃痕實驗檢測CH對A2780細胞遷移能力的影響;采用Transwell實驗檢測CH對A2780細胞侵襲能力的影響;采用RT-qPCR實驗檢測CH對A2780細胞Bcl-2、MMP-2和MMP-9mRNA表達水平的影響。
　　結(jié)果:
　　

6、1.CH對A2780細胞的增殖抑制，隨著濃度的增加(1.25、2.5、5、10、20、40和80μM)和作用時間的延長(24、48、72和96h)，MTT結(jié)果顯示抑制率逐漸增大;CH作用于A2780細胞72h的IC50為30.21±1.24μM。
　　2.CH以不同濃度（2、4、8μM）作用于A2780細胞48h后，流式細胞儀凋亡檢測顯示，與對照組相比，細胞晚期凋亡呈濃度依賴性增加(8.5±1.7％、12.0±1.0％、14.3±

7、2.1％v.s.2.9±0.7％,p＜0.01)。
　　3.CH以8μM的濃度作用于A2780細胞不同時間(24、48h)后，劃痕實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，細胞劃痕愈合率顯著降低（3.8±2.5％v.s.33.3±5.7％，7.1±1.8％v.s.43.5±1.2％,p＜0.01）。
　　4.CH以不同濃度（2、4、8μM）作用于A2780細胞48h后，Transwell檢測顯示，與對照組相比，穿透基底膜進入小室下層的細胞

8、數(shù)呈濃度依賴性減少（79.6±3.6、68.2±3.1、68.2±3.1v.s.101.4±4.9個，p＜0.01），CH對A2780細胞的侵襲抑制率呈濃度依賴性增加（21.5±3.6％、32.7±3.1％、43.0±2.6％）。
　　5.CH以不同濃度（2、4、8μM）作用于A2780細胞48h后，RT-qPCR檢測顯示，Bcl-2、MMP-2和MMP-9的mRNA表達水平均呈濃度依賴性降低。
　　小結(jié):
　　本部分

9、研究表明，CH能夠抑制卵巢癌A2780細胞的增殖，并且其抑制作用具有濃度依賴性和時間依賴性;CH能夠濃度依賴性地促進A2780細胞發(fā)生晚期凋亡，而對早期凋亡無顯著影響，其機制可能和抑制凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因Bcl-2的表達相關(guān);CH能夠抑制A2780細胞的遷移和侵襲能力，其機制可能和抑制遷移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因MMP-2和MMP-9的表達相關(guān)。
　　第二部分 鹽酸千金藤堿對人卵巢癌細胞多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)及其機制的研究
　　目的:
　

10、　本部分以卵巢癌耐藥細胞A2780/Taxol和其親本的A2780細胞為受試對象，旨在研究CH對A2780/Taxol細胞MDR的逆轉(zhuǎn)作用及其相關(guān)機制。
　　方法:
　　采用MTT法檢測不同濃度的紫杉醇作用于A2780/Taxol細胞和A2780細胞72h的增殖抑制率，求得IC50同時計算耐藥倍數(shù);采用MTT法檢測梯度濃度的紫杉醇單獨及其與CH共同作用于A2780/Taxol細胞72h的增殖抑制率，并計算IC50和逆轉(zhuǎn)倍數(shù);

11、采用羅丹明蓄積實驗，通過流式細胞儀檢測并比較A2780/Taxol細胞和A2780細胞的羅丹明123（Rhodamine123，Rho-123）的蓄積能力;采用羅丹明蓄積實驗，通過流式細胞儀檢測CH對A2780/Taxol細胞P-gp功能的影響;采用RT-qPCR法檢測CH對A2780/Taxol細胞MDR1mRNA表達水平的影響:采用Western blot法檢測不同濃度CH對P-gp表達水平的影響;采用Western blot法檢測

12、不同濃度CH對總Akt和磷酸化Akt表達的影響，考察CH對Akt磷酸化的調(diào)節(jié)作用;采用Western Blot法檢測CH單用及與PI3K/Akt通路特異性抑制劑LY294002合用后A2780/Taxol細胞中P-gp表達的變化，考察CH對A2780/Taxol細胞PI3K/Akt通路的影響。
　　結(jié)果:
　　1.紫杉醇對卵巢癌耐藥株A2780/Taxol細胞和敏感株A2780細胞作用72h的IC50分別為1475.0±22

13、.6和39.5±2.8ng/ml;A2780/Taxol細胞的耐藥倍數(shù)為37.3。
　　2.羅丹明蓄積實驗顯示，A2780/Taxol細胞的Rho-123蓄積能力顯著高于A2780細胞(25.1±3.1％v.s.2.6±1.1％,p＜0.01)。
　　3.RT-qPCR實驗顯示，A2780/Taxol細胞MDR1mRNA的表達水平顯著高于A2780細胞。
　　4.梯度濃度的紫杉醇單獨或者與不同濃度(2、4、8μM)的C

14、H共同作用于A2780細胞72h后，MTT法檢測顯示，與紫杉醇單用組相比，CH紫杉醇合用組IC50呈濃度依賴性降低(688.0±7.9、478.3±9.6、185.7±6.5v.s.1475.0±22.6ng/ml，p＜0.01)，CH的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)呈濃度依賴性增加(2.1、3.1、7.9)。
　　5.CH以不同濃度（2、4、8μM）處理A2780/Taxol細胞2h后，羅丹明蓄積實驗檢測顯示，與未處理組相比，CH處理組Rho-123

15、的蓄積呈濃度依賴性升高(13.8±2.2％、17.5±1.0％、23.1±2.1％v.s.2.6±1.1％,p＜0.05)。
　　6.CH以不同濃度（2、4、8μM）作用于A2780/Taxol細胞48h后，RT-qPCR實驗顯示，MDR1mRNA的表達水平呈濃度依賴性降低。
　　7.CH以不同濃度（2、4、8μM）作用于A2780/Taxol細胞48h后，Western blot實驗顯示，P-gp的表達水平呈濃度依賴性降低

16、，總Akt蛋白的表達不變，磷酸化Akt蛋白呈濃度依賴性降低。
　　8.CH與PI3K/Akt通路特異性抑制劑LY294002共同作用后，與CH單獨作用或LY294002單獨作用相比，P-gp表達的下調(diào)顯著加強。
　　小結(jié):
　　本部分研究表明，CH能夠濃度依賴性地逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥株A2780/Taxol細胞的MDR，使其對紫杉醇的敏感性大大增加;CH能夠濃度依賴性地抑制A2780/Taxol細胞的P-gp功能，使其藥物轉(zhuǎn)

17、運泵的作用大大下降;CH能夠濃度依賴性地抑制A2780/Taxol細胞MDR1mRNA的表達、P-gp的表達和磷酸化Akt的表達;CH逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥的機制可能涉及對Akt磷酸化的抑制降低了PI3K/Akt信號通路的活性，從而抑制了P-gp的表達。
　　全文結(jié)論:
　　1.CH能夠顯著抑制卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲，其機制可能和抑制凋亡和遷移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因Bcl-2、MMP-2和MMP-9的表達相關(guān)。
　　2.CH通過