千金藤素對(duì)局灶性腦缺血小鼠的腦保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、腦卒中是當(dāng)前威脅人類(lèi)健康的主要疾病之一。腦梗死后繼發(fā)性腦損傷是病情加重的關(guān)鍵因素，如何減輕繼發(fā)性腦損傷是臨床面臨的重要課題，其損傷機(jī)制復(fù)雜，主要涉及興奮性氨基酸毒性、氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等病理過(guò)程。目前經(jīng)臨床證實(shí)的唯一有效藥物是重組組織型纖溶酶原激活物(recombinant tissue-typeplasminogen-activator，rt-PA)，但其狹窄的治療時(shí)間窗（3-6 h內(nèi)），和腦缺血再灌注損傷、腦水腫，甚至

2、腦出血等并發(fā)癥，其臨床應(yīng)用受到限制。因此尋找快速有效的對(duì)抗腦卒中的藥物，一直是生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)和醫(yī)學(xué)工作者努力的方向。祖國(guó)傳統(tǒng)中草藥具有效果明顯，毒副作用小，也具有多靶點(diǎn)、多方向及多途徑的作用等優(yōu)點(diǎn)。因此，我們從中草藥中篩選具有神經(jīng)保護(hù)作用的藥物。
　　千金藤素(cepharanthine，CEP)是從防己科千金藤屬植物中提取分離出來(lái)的生物堿之一，具有較強(qiáng)的生物活性。CEP臨床上主要用于治療腫瘤患者因放、化療及其它原因所致的白細(xì)

3、胞減少癥。研究報(bào)道，CEP抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB的表達(dá)、血小板聚集、細(xì)胞因子生成，改善大鼠腎臟缺血再灌注損傷。諸多實(shí)驗(yàn)研究表明千金藤素具有抗炎、抑制氧化應(yīng)激、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能等多種生物學(xué)作用。CEP還具有低毒、低廉的特點(diǎn)，如果能證實(shí)CEP為理想的神經(jīng)保護(hù)劑，將具有重要的臨床意義，目前有關(guān)CEP在缺血損傷中的研究和應(yīng)用鮮有報(bào)道。
　　本研究選用雄性CD-1小鼠為研究對(duì)象，采用線栓法建立腦缺血模型，觀察腦缺血損傷后血腦屏障

4、的改變及p38MAPK(mitogen-activated proteinkinases)、JNK(c-jun N-terminal kinase)、NF-κB(nuclear factor-kappa B)及NLRP3、IL-1β等炎癥因子，并選用CEP進(jìn)行干預(yù)，評(píng)價(jià)干預(yù)前后梗死體積、神經(jīng)功能缺損評(píng)分。探討CEP對(duì)NF-κB和p38MAPK、JNK信號(hào)通路和NLRP3、IL-1β的抑制在缺血損傷誘導(dǎo)腦保護(hù)作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。本研究分

5、三部分，現(xiàn)將各部分內(nèi)容概述如下。
　　第一部分 千金藤素對(duì)局灶性腦缺血小鼠的腦保護(hù)作用
　　目的:觀察局灶性腦缺血后神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死體積。研究千金藤素對(duì)腦缺血小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，探討千金藤素神經(jīng)保護(hù)作用的治療時(shí)間窗。
　　方法:選用成年雄性CD-1小鼠為研究對(duì)象，采用改良線栓法制備大腦中動(dòng)脈缺血模型。試驗(yàn)隨機(jī)將CD-1小鼠分為5組:假手術(shù)組(Sham)、手術(shù)組(MCAO)、小劑量千金藤素干預(yù)組(CEP-10)(

6、10 mg/kg)、中劑量千金藤素干預(yù)組(CEP-20)(20 mg/kg)、大劑量干金藤素干預(yù)組(CEP-40)(40mg/kg)。Sham組:假手術(shù)后即刻腹腔注射等量生理鹽水。MCAO組:術(shù)后即刻腹腔注射等量生理鹽水。CEP-10組:術(shù)后即刻腹腔注射千金藤素10 mg/kg。CEP-20組:術(shù)后即刻腹腔注射千金藤素20 mg/kg。CEP-40組:術(shù)后即刻腹腔注射千金藤素40 mg/kg。各組取材前進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，TTC染色評(píng)價(jià)腦

7、梗死體積。
　　結(jié)果:
　　1.Sham組無(wú)神經(jīng)功能缺損，神經(jīng)功能缺損評(píng)分為0分;MCAO組在24 h和72 h神經(jīng)功能缺損評(píng)分較重;CEP-10組在24 h和72 h與MCAO組相比神經(jīng)功能缺損評(píng)分沒(méi)有明顯降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，CEP-20組和CEP-40組在24 h和72 h與MCAO組相比神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.CEP-10組的腦梗死體積在24 h

8、和72 h與MCAO組相比均沒(méi)有顯著降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，CEP-20和CEP-40組的腦梗死體積在24 h和72 h分別與MCAO組相比均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。據(jù)此以上的結(jié)果，表明千金藤素大劑量(40 mg/kg)和中劑量(20 mg/kg)可以發(fā)揮較好的治療效果，因此，我們選擇中劑量千金藤素組(20 mg/kg)進(jìn)行探討其保護(hù)機(jī)制。
　　結(jié)論:缺血后即刻腹腔注射千金藤素對(duì)局灶性腦缺血小

9、鼠具有腦保護(hù)作用，能夠改善腦缺血損傷后的神經(jīng)功能缺損和減小腦梗死體積。
　　第二部分 千金藤素對(duì)局灶性腦缺血小鼠血腦屏障的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制研究
　　目的:觀察腦缺血損傷后血腦屏障的變化，研究千金藤素對(duì)局灶性腦缺血小鼠血腦屏障的保護(hù)作用，探討千金藤素對(duì)血腦屏障的保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制。
　　方法:選用成年雄性CD-1小鼠小鼠為研究對(duì)象，采用改良線栓法制備大腦中動(dòng)脈缺血模型。隨機(jī)將CD-1小鼠分為3組:假手術(shù)組(Sham)

10、、手術(shù)組(MCAO)、中劑量千金藤素干預(yù)組(CEP-20)。Sham組:假手術(shù)后腹腔注射等量生理鹽水。MCAO組:術(shù)后即刻腹腔注射等量生理鹽水。CEP-20組:術(shù)后即刻腹腔注射千金藤素20 mg/kg。各組于取材前2小時(shí)即22小時(shí)給予尾靜脈注射伊文斯藍(lán)(4 mg/kg)染色測(cè)定伊文斯藍(lán)的相對(duì)含量。在大腦中動(dòng)脈閉塞的24 h和72 h后，用干濕重法測(cè)定腦組織含水量，分別用qRT-PCR的方法和Western-blotting的方法檢測(cè)缺血

11、腦組織中ZO-1、occludin、claudin-5 mRNA和蛋白水平的變化。
　　結(jié)果:
　　1.CEP-20組的腦組織含水量在24 h和72 h與MCAO組相明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.CEP-20組在MCAO術(shù)后24 h病變側(cè)腦組織伊文斯藍(lán)含量明顯低于MCAO組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.通過(guò)Western-blotting發(fā)現(xiàn)，與MCAO組相比，CEP-

12、20組ZO-1、occludin、claudin-5蛋白表達(dá)水平在24 h和72 h與MCAO組相比顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.通過(guò)qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，CEP-20組ZO-1、occludin和claudin-5 mRNA水平在24 h和72 h與MCAO組相比顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:腦缺血后24 h和72 h，缺血腦組織的ZO-1、occludin和claudi

13、n-5顯著降低，而千金藤素能夠明顯上調(diào)ZO-1、occludin和claudin-5的表達(dá)，提示千金藤素減輕腦水腫、改善血腦屏障的通透性，保護(hù)血腦屏障，機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)ZO-1、occludin、claudin-5的表達(dá)發(fā)揮其腦保護(hù)作用。
　　第三部分 千金藤素對(duì)局灶性腦缺血小鼠的抗炎作用及其相關(guān)機(jī)制研究
　　目的:觀察腦缺血損傷后炎癥因子的變化，研究千金藤素對(duì)局灶性腦缺血小鼠的抗炎作用，探討千金藤素抑制炎癥反應(yīng)的相關(guān)機(jī)制

14、。
　　方法:選用成年雄性CD-1小鼠小鼠為研究對(duì)象，采用改良線栓法制備大腦中動(dòng)脈缺血模型。隨機(jī)將CD-1小鼠分為3組:假手術(shù)組(Sham)、手術(shù)組(MCAO)、中劑量千金藤素干預(yù)組(CEP-20)。Sham組:假手術(shù)后腹腔注射等量生理鹽水。MCAO組:術(shù)后即刻腹腔注射等量生理鹽水。CEP-20組:術(shù)后即刻腹腔注射千金藤素20 mg/kg。分別用qRT-PCR的方法和Western-blotting的方法檢測(cè)缺血腦組織中NF-κB

15、、phospho-p38MAPK、phospho-JNK、NALP3、IL-1β蛋白水平的變化和激光共聚焦技術(shù)測(cè)定NF-κB、NALP3、IL-1β的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:缺血后24 h和72 h，NF-κB、phospho-p38MAPK、phospho-JNK、NLRP3、IL-1β的表達(dá)均有升高，而千金藤素(20 mg/kg)降低局灶性腦缺血小鼠腦組織中NF-κB、phospho-p38MAPK、phospho-JNK、NL

16、RP3、IL-1β的表達(dá)。
　　1.通過(guò)免疫組化染色分析發(fā)現(xiàn)，與MCAO組相比，CEP-20組NF-κB、p38MAPK、JNK、NALP3、IL-1β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在24 h和72 h均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.通過(guò)激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)元有NF-κB、NLRP3、IL-1β的表達(dá)。缺血后，NF-κB、NLRP3和IL-1β的表達(dá)量明顯增多，而千金藤素能夠抑制NLRP3、IL-1β的表達(dá)及NF-

17、κB核轉(zhuǎn)位。
　　3.通過(guò)Western-blotting分析發(fā)現(xiàn)，CEP組NF-κB、phospho-p38MAPK、phospho-JNK、NALP3、IL-1β的蛋白水平在24 h和72 h與MCAO組相比顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.與免疫組化染色分析和Westem-blotting的結(jié)果相一致，CEP-20組NF-κB、NALP3和IL-1β的mRNA水平在24 h和72h與MCAO組相比明