肉桂醛對局灶性腦缺血小鼠的腦保護作用及相關(guān)機制研究.pdf

1、本研究選用雄性CD-1小鼠為研究對象，應(yīng)用改良Longa線栓法建立小鼠永久性大腦中動脈閉塞模型(permanent middle cerebralartery occlusion，pMCAO)模型。在小鼠永久性大腦中動脈閉塞所致的局灶性腦缺血模型中應(yīng)用肉桂醛進行干預(yù)，通過對腦梗死體積、腦組織含水量及神經(jīng)功能缺損評估，觀察肉桂醛對局灶性腦缺血小鼠的腦保護作用;通過對腦組織炎癥介質(zhì)釋放，中性粒細胞浸潤程度測定，觀察局灶性腦缺血后肉桂醛的抗炎

2、癥損傷作用;通過對TLR4/TRAF6/NF-κB通路相關(guān)因子表達的測定，觀察肉桂醛對TLR4/TRAF6/NF-κB促炎信號通路的影響，探討局灶性腦缺血后肉桂醛抗炎及腦保護作用可能的機制。本研究分為三部分，現(xiàn)將各部分內(nèi)容概述如下。
　　第一部分 肉桂醛對局灶性腦缺血小鼠的腦保護作用
　　目的:觀察小鼠局灶性腦缺血后神經(jīng)功能缺損評分、腦組織含水量、腦梗死體積。研究肉桂醛對局灶性腦缺血小鼠的腦保護作用。
　　方法:選用成

3、年雄性CD-1小鼠、采用改良線栓法制備大腦中動脈閉塞模型。在大腦中動脈閉塞的24 h和72 h后，通過Bederson法評價神經(jīng)功能缺損，干濕重法測定腦組織含水量，2％2，3，5-三苯基四唑氮紅(triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色法測定腦梗死體積，觀察肉桂醛的神經(jīng)保護作用。隨機將CD-1小鼠分為7組:假手術(shù)組(Sham+生理鹽水，Sham+0.2％ DMSO):小鼠假手術(shù)后腹腔注射等量生理鹽水或者0

4、.2％ DMSO;大腦中動脈閉塞組(MCAO+生理鹽水，MCAO+0.2％ DMSO):小鼠大腦中動脈閉塞后即刻腹腔注射等量生理鹽水或者0.2％ DMSO;肉桂醛低劑量組（CA25組）:小鼠大腦中動脈閉塞后即刻腹腔注射肉桂醛25 mg/kg;肉桂醛中劑量組（CA50組）:小鼠大腦中動脈閉塞后即刻腹腔注射肉桂醛50 mg/kg;肉桂醛高劑量組（CA75組）:小鼠大腦中動脈閉塞后即刻腹腔注射肉桂醛75mg/kg。通過預(yù)實驗，我們在假手術(shù)組和

5、大腦中動脈閉塞組中發(fā)現(xiàn)小鼠給予等量生理鹽水或者0.2％ DMSO，兩者神經(jīng)功能缺損評分，腦組織含水量，腦梗死體積測定是沒有統(tǒng)計學(xué)差異的，因此，我們除外了溶劑，即0.2％ DMSO的生物學(xué)效應(yīng)。最終共有5組:Sham組（小鼠假手術(shù)后腹腔注射0.2％ DMSO），MCAO組(小鼠大腦中動脈閉塞后腹腔注射0.2％ DMSO)，CA25組，CA50組和CA75組被納入接下來的試驗。為了更進一步評價肉桂醛的腦保護作用，我們觀察了肉桂醛不同時間點給

6、藥對局灶性腦缺血小鼠的腦保護作用。分別在缺血前1h，缺血后即刻、4h及8h，腹腔注射肉桂醛50 mg/kg，在缺血后24 h觀察小鼠的神經(jīng)功能缺損評分，腦梗死體積，從而評價肉桂醛于不同時間點給藥對腦缺血小鼠的腦保護作用。
　　結(jié)果:
　　1.Sham組無神經(jīng)功能缺損，神經(jīng)功能缺損評分為0分;MCAO組在24 h和72 h神經(jīng)功能缺損評分均較嚴(yán)重;CA25組在24 h和72 h與MCAO組相比神經(jīng)功能缺損評分沒有明顯降低，差異

7、無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），CA50組和CA75組在24 h和72 h與MCAO組相比神經(jīng)功能缺損評分明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.CA25組的腦組織含水量在24 h和72 h與MCAO組相比均沒有明顯降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，CA50組和CA75組的腦組織含水量在24 h和72 h與MCAO組相比均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3.CA25組的腦梗死體積在24

8、 h和72 h與MCAO組相比均沒有顯著降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，CA50和CA75組的腦梗死體積在24 h和72 h分別與MCAO組相比均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。據(jù)此，我們從神經(jīng)功能缺損評分，腦水腫，腦梗死體積三方面觀察，發(fā)現(xiàn)肉桂醛以高劑量(75 mg/kg)和中劑量(50mg/kg)給藥時可以發(fā)揮較好的治療效果，因此，后續(xù)的研究主要集中在肉桂醛的中劑量（50 mg/kg）。
　　4.于缺血前

9、1小時，缺血后后即刻和4小時腹腔給予肉桂醛(50mg/kg)，神經(jīng)功能缺損評分和梗死體積較MCAO組明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而在缺血后8小時給予肉桂醛，神經(jīng)功能缺損評分和梗死體積和MCAO組相比無明顯降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:缺血后即刻腹腔注射肉桂醛對局灶性腦缺血小鼠具有腦保護作用，能夠改善腦缺血損傷后的神經(jīng)功能缺損，減輕腦組織含水量并減小腦梗死體積。不僅如此，肉桂醛于缺血前1小時，

10、缺血后4小時給藥仍然具有腦保護作用。
　　第二部分 肉桂醛對局灶性腦缺血小鼠的抗炎作用
　　目的:通過對腦組織炎癥介質(zhì)釋放，中性粒細胞浸潤程度測定，觀察局灶性腦缺血后肉桂醛的抗炎癥損傷作用。
　　方法:選用成年雄性CD-1小鼠為研究對象，采用改良Longa線栓法制備大腦中動脈閉塞模型。隨機將CD-1小鼠分為3組:假手術(shù)組（Sham組），假手術(shù)后腹腔注射0.2％ DMSO;大腦中動脈閉塞組(MCAO組)，小鼠大腦中動脈閉

11、塞后腹腔注射等量0.2％ DMSO;肉桂醛中劑量組（CA50組），小鼠大腦中動脈閉塞后腹腔注射肉桂醛50 mg/kg;各組取材前進行神經(jīng)功能缺損評分，分別于缺血后24 h和72 h，應(yīng)用免疫組化，Western-blot，MPO活性試劑盒及qRT-PCR方法檢測缺血腦組織中MPO表達、MPO活性和炎癥介質(zhì)轉(zhuǎn)錄水平的變化。
　　結(jié)果:缺血后24 h和72 h，MPO的表達及活性均有升高，肉桂醛(50mg/kg)干預(yù)后MPO表達水平及

12、活性下降。
　　1.通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，與MCAO組相比，CA50組的MPO陽性細胞表達在24 h和72 h均有顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.通過Western-blot發(fā)現(xiàn)，與MCAO組相比，CA50組MPO蛋白表達水平在24 h和72 h與MCAO組相比顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3.與免疫組化染色和Western-blot的結(jié)果一致，CA50組的MPO活性在24

13、h和72 h和MCAO組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，炎癥介質(zhì)(TNF-α，IL-1β，MCP-1，ELAM-1)在局灶性腦缺后24 h顯著升高，肉桂醛(50 mg/kg)于局灶性腦缺血后24 h能夠顯著降低上述炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄水平，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。在局灶性缺血72 h后，和MCAO組相比，CA50組TNF-α和MCP-1 mRNA水平明顯減低(P＜0.05)，

14、然而，IL-1β和ELAM-1 mRNA水平?jīng)]有明顯變化(P＞0.05)。
　　結(jié)論:局灶性腦缺血后24 h和72 h，缺血腦組織的炎癥介質(zhì)（炎性因子，趨化因子及粘附因子）的轉(zhuǎn)錄水平及MPO表達、活性均顯著升高，而肉桂醛能夠明顯減低缺血腦組織炎癥介質(zhì)的釋放、MPO表達及MPO活性，提示肉桂醛能夠抑制缺血腦組織炎癥介質(zhì)的釋放及中性粒細胞的浸潤。而肉桂醛抑制炎癥介質(zhì)釋放及中性粒細胞浸潤和對局灶性腦缺血小鼠的腦保護作用是一致的，故我們推

15、測肉桂醛可能通過抗炎癥損傷發(fā)揮其腦保護作用。
　　第三部分 肉桂醛對局灶性腦缺血后TLR4/TRAF6/NF-κB通路影響
　　目的:觀察腦缺血損傷后不同時間點TLR4/TRAF6/NF-κB通路相關(guān)因子的表達變化，研究肉桂醛對局灶性腦缺血小鼠抗炎及神經(jīng)保護作用的可能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。
　　方法:選用成年雄性CD-1小鼠為研究對象，應(yīng)用改良Longa線栓法制備小鼠右側(cè)大腦中動脈阻塞模型(MCAO)。隨機將CD-1小鼠分為3

16、組:假手術(shù)組（Sham組），假手術(shù)后腹腔注射0.2％ DMSO;大腦中動脈阻塞組（MCAO組），小鼠大腦中動脈阻塞后腹腔注射等量0.2％ DMSO;肉桂醛中劑量組（CA50組），小鼠大腦中動脈阻塞后腹腔注射肉桂醛50 mg/kg;各組取材前進行神經(jīng)功能評分，分別用免疫組化，Western-blot和qRT-PCR的方法檢測不同時間點缺血腦組織中TLR4，TRAF6及NF-κB蛋白表達和mRNA水平的變化。
　　結(jié)果:缺血后24 h

17、和72 h，TLR4、TRAF6及NF-κB的表達均有升高，而肉桂醛(50 mg/kg)降低局灶性腦缺血小鼠腦組織中TLR4、TRAF6及NF-κB表達。
　　1.通過免疫組化染色分析發(fā)現(xiàn)，與MCAO組相比，CA50組TLR4、TRAF6及NF-κB陽性細胞數(shù)在24 h和72 h均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.通過Western-blot分析發(fā)現(xiàn)，CA50組TLR4、TRAF6及NF-κB蛋白表達水平

18、在24 h和72 h與MCAO組相比顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3.與免疫組化染色分析和Western-blot的結(jié)果一致，CA50組mRNA水平在24 h和72 h與MCAO組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論:局灶性腦缺血后，肉桂醛對缺血腦組織中的TLR4、TRAF6、NF-κB表達的抑制與肉桂醛腦保護作用及抗炎癥損傷程度一致，提示肉桂醛有可能通過抑制TLR4/TRAF6/N