小柴胡湯調(diào)控miR-122逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥的作用機(jī)制.pdf

1、目的:
　　通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究小柴胡湯對(duì)肝癌多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用，并探討其機(jī)制及作用靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1.體外實(shí)驗(yàn):通過(guò)MTT法檢測(cè)肝癌親本細(xì)胞BEL-7402及耐藥細(xì)胞株BEL-7402/5-FU的細(xì)胞活力，應(yīng)用SPSS軟件計(jì)算耐藥指數(shù)和小柴胡湯的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)，驗(yàn)證BEL-7402/5-FU耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性以及小柴胡湯對(duì)化療藥物的逆轉(zhuǎn)耐藥作用;MTT法檢測(cè)小柴胡湯對(duì)耐藥細(xì)胞的活力的影響，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)

2、胞的形態(tài)學(xué)變化，集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小柴胡湯對(duì)耐藥細(xì)胞存活能力的影響，流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期分布研究小柴胡湯對(duì)BEL-7402/5-FU耐藥細(xì)胞增殖的影響;Hoechst33258染色觀察小柴胡湯對(duì)BEL-7402/5-FU耐藥細(xì)胞凋亡的影響;AnnexinⅤ-PI凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡研究小柴胡湯對(duì)BEL-7402/5-FU細(xì)胞凋亡的影響;采用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)ATP含量;高效液相色譜儀(HPLC)檢測(cè)小柴胡湯對(duì)細(xì)胞內(nèi)

3、5-FU蓄積的影響;流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)小柴胡湯對(duì)細(xì)胞內(nèi)阿霉素(ADM)和羅丹明(Rho123)濃度的影響。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western Blot法檢測(cè)小柴胡湯對(duì)Bax、Bcl-2、CyclinG1及ABCB1(p-gp)、ABCC1(MRP1)、ABCG2(BCRP)在mRNA和蛋白水平表達(dá)的影響。
　　2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):分別將BEL-7402細(xì)胞及其耐藥株BEL-7402/5-FU細(xì)胞接種于裸鼠腋下

4、建立裸鼠的皮下移植瘤模型，用5-FU(20 mg/kg)連續(xù)干預(yù)21天，檢測(cè)兩種移植瘤裸鼠的體重、瘤體變化和瘤重等觀察耐藥細(xì)胞建立的皮下移植瘤組織的耐藥性;建立裸鼠的耐藥移植瘤模型，按照體重隨機(jī)分為對(duì)照組、5-FU組(20 mg/kg)、小柴胡湯組(XCHT，14.2 g/kg)和聯(lián)合給藥（5-FU+XCHT）組，分別給藥21天，檢測(cè)體重變化評(píng)估藥物的毒副作用，觀察和測(cè)量移植瘤裸鼠的腫瘤體積和重量評(píng)估小柴胡湯對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響;通過(guò)

5、TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling(TUNEL)法檢測(cè)小柴胡湯對(duì)耐藥移植瘤組織細(xì)胞凋亡的影響，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法(IHC)研究小柴胡湯對(duì)耐藥移植瘤組織Ki-67表達(dá)的影響;通過(guò)RT-PCR和Western-Blot法檢測(cè)小柴胡湯對(duì)Bax、Bcl-2、CyclinG1及ABCB1(p-gp)、ABCC1(MRP1)、ABCG2(BCRP) mRNA和蛋白表達(dá)的影響。
　　3.靶點(diǎn)驗(yàn)證:繪制BEL-

6、7402和BEL-7402/5-FU細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，分別計(jì)算其倍增時(shí)間;qPCR檢測(cè)BEL-7402和BEL-7402/5-FU細(xì)胞及其移植瘤組織miR-122的表達(dá);BEL-7402和BEL-7402/5-FU細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染inhibitor-miR-122(ASO-miR-122)或mimics-miR-122，檢測(cè)miR-122表達(dá)及對(duì)化療藥物耐藥性;觀察BEL-7402/5-FU細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimics-miR-122后的細(xì)胞形態(tài)及細(xì)

7、胞數(shù)改變，DAPI染色和AnnexinⅤ-PI凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)miR-122對(duì)細(xì)胞凋亡影響;克隆形成實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞周期檢測(cè)miR-122對(duì)細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Rho123和ADM的蓄積情況，觀察miR-122對(duì)藥物外排功能的影響。采用qPCR和Western Blot法檢測(cè)miR-122對(duì)靶基因Bax、CDK4、CyclinG1和ABCB1表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1、細(xì)胞實(shí)驗(yàn):(1)BEL-7402/5-

8、FU細(xì)胞經(jīng)5-FU、ADM和DDP干預(yù)48 h后的IC50均顯著大于BEL-7402細(xì)胞，耐藥指數(shù)(RI)分別為6501.99，31.73和13.82;(2)0.5 mg/mL或1.0 mg/mL小柴胡湯分別與5-FU和ADM聯(lián)合干預(yù)BEL-7402和BEL-7402/5-FU，與單獨(dú)使用5-FU和ADM相比較，兩株細(xì)胞的IC50均顯著降低，0.5 mg/mL或1.0 mg/mL小柴胡湯對(duì)5-FU和ADM的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別是1.66，3.4

9、4和1.50，5.58，相對(duì)逆轉(zhuǎn)率分別為39.88％，71.34％和34.11％，84.51％;(3)小柴胡湯抑制BEL-7402/5-FU細(xì)胞增殖:MTT檢測(cè)細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)小柴胡湯顯著降低BEL-7402/5-FU細(xì)胞活力，呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性;倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)不同濃度小柴胡湯均可以不同程度抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，且隨著濃度增高，其抑制程度也越強(qiáng);集落形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同濃度小柴胡湯均能夠不同程度減少集落形成數(shù)量，影響細(xì)胞的生存能力;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)

10、胞周期發(fā)現(xiàn)小柴胡湯能夠改變細(xì)胞周期分布，使BEL-7402/5-FU細(xì)胞阻滯于G2/M期;小柴胡湯下調(diào)CyclinG1的表達(dá)。(4)小柴胡湯誘導(dǎo)BEL-7402/5-FU細(xì)胞凋亡:熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)小柴胡湯能夠誘導(dǎo)BEL-7402/5-FU細(xì)胞凋亡，不同濃度小柴胡湯濃度干預(yù)可使細(xì)胞密度減小，核高染（亮染）的細(xì)胞數(shù)增加;AnnexinⅤ-PI凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示小柴胡湯誘導(dǎo)BEL-7402/5-FU細(xì)胞早期凋亡，且呈劑量依賴(lài);小柴胡湯上調(diào)Ba

11、x表達(dá)，下調(diào)Bcl-2表達(dá)。(5)小柴胡湯抑制藥物泵的外排作用:小柴胡湯能夠顯著增加5-FU和ADM在BEL-7402/5-FU細(xì)胞內(nèi)的蓄積;小柴胡湯增加BEL-7402/5-FU細(xì)胞內(nèi)Rho123的蓄積;小柴胡湯顯著降低BEL-7402/5-FU細(xì)胞內(nèi)ATP的含量;小柴胡湯能夠顯著下調(diào)多藥耐藥相關(guān)基因ABCB1、ABCC1及ABCG2的mRNA和蛋白表達(dá)。
　　2、動(dòng)物實(shí)驗(yàn):(1)BEL-7402和BEL-7402/5-FU細(xì)胞

12、移植瘤的體積和重量檢測(cè)結(jié)果提示BEL-7402/5-FU細(xì)胞移植瘤較BEL-7402細(xì)胞移植瘤具有更明顯的耐藥性，而小柴胡湯能夠顯著抑制移植瘤生長(zhǎng)，表明小柴胡湯可以降低BEL-7402/5-FU細(xì)胞移植瘤的化療耐藥;(2)TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，小柴胡湯和聯(lián)合給藥均可以顯著增加TUNEL的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率，促進(jìn)耐藥移植瘤組織的細(xì)胞凋亡，5-FU對(duì)TUNEL的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率沒(méi)有明顯影響;(3)IHC檢測(cè)Ki-67表達(dá)結(jié)果發(fā)

13、現(xiàn)小柴胡湯能夠顯著增加Ki-67的陽(yáng)性表達(dá)率，抑制耐藥移植瘤細(xì)胞增殖，而5-FU對(duì)耐藥移植瘤組織的細(xì)胞增殖未見(jiàn)明顯變化;(4)RT-PCR和Western-blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)小柴胡湯能夠顯著下調(diào)Bcl-2、cyclinG1和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCB1、ABCC1、ABCG2的表達(dá)，上調(diào)Bax的表達(dá);而5-FU對(duì)上述相關(guān)基因表達(dá)未見(jiàn)顯著影響。
　　3、靶點(diǎn)驗(yàn)證:與BEL-7402細(xì)胞比較，BEL-7402/5-FU細(xì)胞倍增時(shí)間延長(zhǎng)17.04

14、h，且具有更高的耐藥性;BEL-7402/5-FU細(xì)胞或移植瘤組織miR-122表達(dá)降低，與BEL-7402細(xì)胞或移植瘤比較，分別降低0.57倍和0.61倍，小柴胡湯增加耐藥細(xì)胞或移植瘤中miR-122的表達(dá)，分別升高2.36倍和2.82倍;BEL-7402和BEL-7402/5-FU細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染inhibitors-miR-122或mimics-miR-122后，miR-122表達(dá)分別降低0.71倍或升高2056.98倍;BEL-74

15、02轉(zhuǎn)染inhibitors-miR-122后，對(duì)5-FU耐藥性沒(méi)有明顯改變，BEL-7402/5-FU細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimics-miR-122，在0-1200μ M范圍內(nèi)，增加BEL-7402/5-FU對(duì)5-FU的敏感性;BEL-7402/5-FU細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimics-miR-122能夠抑制BEL-7402/5-FU細(xì)胞生長(zhǎng)，增加其對(duì)5-FU的敏感性;miR-122能夠促進(jìn)BEL-7402/5-FU細(xì)胞細(xì)胞凋亡;miR-122可以抑制BE

16、L-7402/5-FU細(xì)胞增殖;miR-122增加ADM和Rho123在BEL-7402/5-FU細(xì)胞內(nèi)的蓄積;miR-122調(diào)節(jié)靶基因Bax、CDK4、CyclinG1和ABCB1的mRNA和蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小柴胡湯能夠逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥;
　　2.小柴胡湯逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥機(jī)制可能有以下幾個(gè)方面:
　　(1)小柴胡湯顯著抑制耐藥細(xì)胞BEL-7402/5-FU細(xì)胞增殖;