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文檔簡介
1、目的:研究人肝癌多藥耐藥產(chǎn)生的機(jī)理及耐藥性產(chǎn)生之后生物學(xué)行為的變化,發(fā)夾狀RNA(smallhairpinRNA,shRNA)對(duì)人肝癌多藥耐藥細(xì)胞株的逆轉(zhuǎn)效果。 方法:建立人肝癌HepG2多藥耐藥細(xì)胞系HepG/ADM,檢測其部分生物學(xué)性狀,并設(shè)計(jì)兩條針對(duì)MDR1基因的shRNA,觀察其對(duì)多藥耐藥細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)效果。(1)HepG2/ADM的建立及其鑒定:應(yīng)用HepG2細(xì)胞系,通過培養(yǎng)液中阿霉素的濃度梯度遞增法,長期篩選培養(yǎng),得到人
2、肝癌多藥耐藥株HepG2/ADM。以MTT法檢測HepG2/ADM的多藥耐藥性;用流式細(xì)胞術(shù)檢測其細(xì)胞周期的分布,細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度及加藥后細(xì)胞周期的變化;用熒光定量RT-PCR方法檢測多藥耐藥基因MDR1、LRP、MRP、BCRP的基因表達(dá)水平;Western-blotting增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(Enhancedchemilluminesence,ECL)檢測細(xì)胞株表面MDR1蛋白P-gp、多藥耐藥相關(guān)蛋白MRP、LRP及BCRP的表達(dá)水平
3、。(2)HepG2/ADM細(xì)胞生物學(xué)行為變化的研究:利用透射電鏡研究人肝癌多藥耐藥細(xì)胞HepG2/ADM及其親本細(xì)胞HepG2的超微結(jié)構(gòu);利用熒光定量PCR技術(shù)檢測脂質(zhì)過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisomeproliferator-activatedreceptors,PPARα)mRNA及胚胎發(fā)育相關(guān)基因Twist在兩種細(xì)胞系中的表達(dá)水平;利用Western-blotting增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測PPARα蛋白及Twist蛋白
4、在兩種細(xì)胞中的表達(dá)情況。(3)shRNA對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞耐藥性逆轉(zhuǎn)的研究:設(shè)計(jì)兩條針對(duì)MDR1基因的shRNA,并將其分別構(gòu)建在pGenSil-1質(zhì)粒中;然后將這兩條shRNA分別轉(zhuǎn)染HepG2/ADM細(xì)胞;利用羅丹明外排法、熒光定量PCR及細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)來檢測這兩條shRNA對(duì)HepG2/ADM的多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用。 結(jié)論:(1)HepG2/ADM細(xì)胞是一個(gè)明確的多藥耐藥模型,具有耐藥細(xì)胞的基本特性,其多藥耐藥性可能主
5、要與MDR1及BCRP的高表達(dá)有關(guān),其中前者起主要作用,后者起輔助作用??梢岳眠@個(gè)模型對(duì)人肝癌的多藥耐藥機(jī)制進(jìn)行深入研究。同親本細(xì)胞相比,對(duì)長春新堿(VCR)等8種抗癌藥的抗性提高了1.22~107.56倍、倍增時(shí)間延長2.05倍、細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積明顯降低、細(xì)胞周期分布無明顯改變;其多藥耐藥性主要與MDR1的高表達(dá)有關(guān)。G2期可能是阿霉素使細(xì)胞凋亡的檢測點(diǎn)。(2)與其親本細(xì)胞相比,HepG2/ADM細(xì)胞生物學(xué)行為發(fā)生了改變。PPARα與
6、HepG2/ADM細(xì)胞的多藥耐藥現(xiàn)象有關(guān),PPARα表達(dá)下調(diào)可能是腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性形成的機(jī)制之一;也可能是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性后的結(jié)果,耐藥細(xì)胞可能通過下調(diào)PPARot表達(dá)而產(chǎn)生一些生物學(xué)行為上的變化。這兩種猜測都有待于進(jìn)一步的研究證實(shí)。Twist在HepG2/ADM中表達(dá)上調(diào)。鑒于Twist是一個(gè)調(diào)控腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的開關(guān)基因,因此,我們推測,與其親本細(xì)胞相比,HepG2/ADM細(xì)胞的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散能力增加。(3)可以利用shRNA逆轉(zhuǎn)He
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