p15因子與肝癌多藥耐藥的相關性及作用機制的研究.pdf

1、腫瘤的多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）現(xiàn)象是導致化療失敗的主要因素，也是影響患者生存的主要因素。據(jù)統(tǒng)計，有90％以上的腫瘤患者其化療失敗的原因不同程度地與MDR有關。而TGF-beta/Smads信號傳導通路在調(diào)節(jié)腫瘤多藥耐藥起到非常重要的雙向調(diào)節(jié)作用：腫瘤發(fā)生早期，TGF-beta通過其廣泛的多細胞抑制達到腫瘤抑制因子的作用；腫瘤形成后期，則促進腫瘤細胞增殖的。 P15，即細胞周期素依賴性蛋白激酶

2、抑制因子2B，又稱Cdkn2b、INK4B，屬INK4蛋白家族，又稱多腫瘤抑制基因（MTS1）。P15系TGF-beta/smads信號傳導系統(tǒng)下游區(qū)的十分重要的細胞生長周期的抑制因子，其表達受到TGF beta的誘導，在TGF beta信號轉導通路中主要介導G1期阻滯的作用[3、6]。通過Smad介導的轉錄和myc所致的生長阻滯的解除，TGF-β可以快速誘導P15在許多不同類型的細胞中的表達[7]。同時TGF-β抑制cdk2激酶活性，

3、提高p15蛋白的表達水平。 所以，本課題擬通過調(diào)節(jié)HepG2/CDDP耐藥細胞株中p15蛋白的表達，進而探討p15與HepG2/CDDP耐藥細胞株多藥耐藥的相關性及其可能的調(diào)控作用機制。 目的:（1）檢測P15在HepG2/CDDP動態(tài)的耐藥模型中的表達情況。（2）P15對HepG2耐藥細胞的表型的作用；（3）探討p15介導HepG2/CDDP細胞株多藥耐藥性變化的可能機制。 方法:（1）采用低濃度逐步遞增法，建

4、立HepG2/CDDP動態(tài)的耐藥模型[9、10、11]；（2）將P15編碼區(qū)片段插入pcDNA3.1以及構建P15正義表達載體，將HepG2耐藥細胞分成3組，分別用P15正義表達載體、pcDNA3.1空載體利用脂質(zhì)體轉染到其中2組，另一組為陰性對照組，Western blot驗證轉染；（3）RT-PCR和Western blot檢測P15的表達；（4）流式細胞儀檢測HepG2/CDDP耐藥細胞株內(nèi)阿霉素的蓄積和潴留，并以此計算藥物的泵出

5、率；（5）流式細胞儀對轉染細胞及其對照細胞進行細胞周期分析，并計算細胞的增殖指數(shù)（PI）；（6）Western blot檢測細胞膜藥物轉運相關蛋白MRP、P-gp蛋白的表達；（7）Western blot檢測及細胞凋亡分子BCL-2、Bax的表達。 結果: （1）成功用順鉑誘導HepG2耐藥，并建立HepG2/CDDP耐藥模型，耐藥指數(shù)為6.75μg/ml； （2）RT-PCR和Western blot檢測P15

6、在2.Oμg/ml的CDDP誘導培養(yǎng)HepG2/CDDP耐藥細胞24h、48h、3d、Sd、7d后，隨著HepG2/CDDP耐藥細胞株耐藥表型的增強，P15表達水平逐漸下降； （3）成功構建p15正義表達載體；穩(wěn)定轉染細胞后建立P15表達升高的細胞系 HepG2/CDDP-pcDNA3.1-p15，空載體對照細胞系HepG2/CDDP-pcDNA3.1及親本細胞HepG2/CDDP，RT-PCR和Western blot驗證轉染

7、成功，p15正義表達載體可上調(diào)P15的表達； （4）HepG2/CDDP-pcDNA3.1-p15細胞內(nèi)阿霉素的蓄積和潴留增高； （5）HepG2/CDDP-pcDNA3.1-p15細胞增殖指數(shù)降低，細胞增殖能力減弱； （6）HepG2/CDDP-pcDNA3.1-p15細胞的MRP、P-gp蛋白的表達下降； （7）HepG2/CDDP-pcDNA3.1-p15細胞的Bcl-2表達下降，Bax表達上升。