轉(zhuǎn)錄因子CUTL1在胃癌多藥耐藥中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、【背景】
　　胃癌是是最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率在世界范圍內(nèi)位于惡性腫瘤的第二位。隨著醫(yī)學(xué)研究的不斷進(jìn)步和發(fā)展，胃癌的治療方法和策略也得到不斷完善，但化療仍然是胃癌治療的主要手段之一。而多藥耐藥（multidrug resistance,MDR）的出現(xiàn)，往往使得化療失敗，導(dǎo)致胃癌患者預(yù)后較差，5年生存率不足40％。因此，闡明胃癌多藥耐藥的機(jī)制勢在必行。國內(nèi)外學(xué)者，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的胃癌多藥耐藥相關(guān)基因和分子。我們實(shí)驗(yàn)室也建立了胃

2、癌耐藥細(xì)胞亞系，并應(yīng)用抑制消減雜交、差異顯示PCR、部分隨機(jī)siRNA文庫和miRNA芯片等策略，成功篩選并鑒定出一系列耐藥相關(guān)的基因和miRNA。但由于胃癌的耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，這些結(jié)果尚不能完全闡明胃癌多藥耐藥的本質(zhì)。因此，采用新策略繼續(xù)深入研究胃癌多藥耐藥機(jī)制具有非常重要的意義。
　　轉(zhuǎn)錄因子是一類重要的基因調(diào)控分子，參與多種細(xì)胞生物學(xué)過程，如：細(xì)胞分化、增殖、凋亡、細(xì)胞周期進(jìn)展和腫瘤發(fā)生發(fā)展等。近年來，轉(zhuǎn)錄因子在多藥耐藥中的

3、作用逐漸得到公認(rèn)。新近出現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子活性譜芯片（oligonucleotide array-based transcription factor assay，OATFA），為體外研究轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合活性提供了新的思路和策略。我們課題組前期利用此芯片，在胃癌阿霉素耐藥細(xì)胞SGC7901/ADR和親本細(xì)胞SGC7901中篩選出差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，其中CUTL1差異最明顯，推測CUTL1有可能參與胃癌多藥耐藥。
　　CUTL1，屬于轉(zhuǎn)

4、錄因子同源結(jié)構(gòu)域家族，其在進(jìn)化上高度保守。CUTL1的表達(dá)水平和活性受到廣泛的調(diào)節(jié)，包括轉(zhuǎn)錄起始的改變，蛋白酶解加工，磷酸化和乙?；?，并且這些調(diào)節(jié)均通過對細(xì)胞周期的調(diào)控發(fā)揮作用。同時(shí)，CUTL1可以通過轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制的方式，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，從而參與多種細(xì)胞生物學(xué)功能，如細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞遷移和侵襲等。文獻(xiàn)報(bào)道，CUTL1可以通過抑制凋亡而促進(jìn)胰腺癌多藥耐藥的發(fā)生。因此，我們認(rèn)為深入研究轉(zhuǎn)錄因子CUTL1在胃癌多

5、藥耐藥中的作用和機(jī)制，具有非常重要的意義，有可能為臨床逆轉(zhuǎn)多藥耐藥提供新的思路和靶標(biāo)。
　　【目的】
　　從多水平多角度研究轉(zhuǎn)錄因子CUTL1在胃癌多藥耐藥中的作用，并初步探討其可能的分子機(jī)制。
　　【方法】
　　1、利用MTT方法檢測脫藥培養(yǎng)2周的胃癌阿霉素耐藥細(xì)胞、給藥培養(yǎng)的耐藥細(xì)胞和親本細(xì)胞對化療藥物的敏感性；
　　2、PCR、Western blot和EMSA實(shí)驗(yàn)檢測SGC7901/ADR細(xì)胞和SG

6、C7901細(xì)胞中CUTL1的表達(dá)量和DNA結(jié)合活性；
　　3、收集新鮮的胃癌活檢組織標(biāo)本，利用EMSA檢測胃癌組織標(biāo)本中CUTL1的結(jié)合活性，利用組織培養(yǎng)藥物敏感性檢測技術(shù)判斷新鮮胃癌組織標(biāo)本對化療藥物的敏感性，結(jié)合兩者，從組織水平分析CUTL1活性與藥物敏感性的相關(guān)性；
　　4、擴(kuò)增和鑒定 CUTL1正義和反義載體，并分別感染和轉(zhuǎn)染SGC7901/ADR和SGC7901細(xì)胞，通過RT-PCR和Western blot檢測感

7、染和轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中CUTL1的表達(dá)量；
　　5、MTT方法檢測感染和轉(zhuǎn)染后細(xì)胞對常見化療藥物的敏感性；
　　6、通過流式細(xì)胞術(shù)分析 CUTL1對胃癌細(xì)胞凋亡的影響；
　　7、建立裸鼠成瘤模型，進(jìn)一步在體內(nèi)證實(shí) CUTL1對藥物敏感性的影響；
　　8、通過報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、qPCR、Western blot和MTT等方法對CUTL1的靶基因BMP6進(jìn)行功能驗(yàn)證，以初步探討CUTL1參與胃癌多藥耐藥的可能分子機(jī)制。

8、　　【結(jié)果】
　　1、轉(zhuǎn)錄因子CUTL1在胃癌耐藥細(xì)胞中的表達(dá)量和活性降低
　　我們分別給藥培養(yǎng)和脫藥培養(yǎng)2周阿霉素耐藥胃癌細(xì)胞SGC7901/ADR，然后利用MTT方法檢測其對化療藥物的敏感性，結(jié)果顯示，脫藥培養(yǎng)2周后，SGC7901/ADR與給藥培養(yǎng)的細(xì)胞對化療藥物的敏感性無明顯差別，而二者均明顯低于SGC7901的藥物敏感性。
　　我們利用RT-PCR、Western blot和EMSA方法檢測SGC7901/A

9、DR和SGC7901細(xì)胞中CUTL1的表達(dá)量和表達(dá)活性，結(jié)果顯示，SGC7901/ADR細(xì)胞中CUTL1的表達(dá)量和表達(dá)活性均明顯低于SGC7901細(xì)胞，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　2、CUTL1活性與胃癌組織的多藥耐藥性呈負(fù)相關(guān)
　　我們利用EMSA實(shí)驗(yàn)檢測33例新鮮胃癌組織標(biāo)本中CUTL1的活性，以滯后條帶灰度值的平均值為準(zhǔn)，其中16例被納入CUTL1高活性組，17例納入CUTL1低活性組。HDRA對33例胃癌組

10、織標(biāo)本對化療藥物的敏感性進(jìn)行檢測，以抑制率大于50%為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示，17例標(biāo)本對化療藥物呈內(nèi)源性的耐藥，而且其中13例的CUTL1活性較低，提示CUTL1高活性組中的抑制率明顯高于 CUTL1低活性組，p<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可見CUTL1活性與胃癌組織的多藥耐藥性呈負(fù)相關(guān)。
　　3、CUTL1在胃癌細(xì)胞多藥耐藥中的作用
　　我們成功擴(kuò)增了CUTL1正義和反義載體，并分別感染和轉(zhuǎn)染SGC7901/ADR細(xì)胞和SGC7

11、901/MKN45細(xì)胞，分別命名為：SGC7901/ADR-CUTL1，SGC7901/ADR-VC，SGC7901-shRNA和SGC7901-VC，MKN45-shRNA和MKN45-VC。RT-PCR、Western blot結(jié)果均提示 CUTL1在 SGC7901/MKN45-shRNA中的表達(dá)明顯低于SGC7901-VC，MTT結(jié)果提示SGC7901-shRNA對多種化療藥物的敏感性明顯低于SGC7901-VC. CUTL1在

12、SGC7901/ADR-CUTL1中的表達(dá)明顯高于SGC7901/ADR-VC，其對藥物的敏感性也高于SGC7901/ADR-VC。
　　Annexin V/PI染色法檢測細(xì)胞受藥物誘導(dǎo)調(diào)亡的變化，發(fā)現(xiàn)上調(diào)CUTL1表達(dá)能夠明顯增加 SGC7901/ADR細(xì)胞對ADR的藥物敏感性,降低 CUTL1表達(dá)能夠明顯降低 SGC7901/MKN45細(xì)胞對ADR的藥物敏感性。SGC7901/ADR-CUTL1成瘤后，給予化療藥物，腫瘤的抑制

13、率明顯高于SGC7901/ADR-VC組，而 SGC7901-shRNA組的腫瘤抑制率低于SGC7901-VC。
　　4、CUTL1可能通過BMP6參與胃癌多藥耐藥
　　CUTL1可以抑制BMP6的表達(dá)，并且CUTL1可以與BMP6啟動(dòng)子結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)錄。siRNA阻斷BMP6的表達(dá)后，可以增強(qiáng)CUTL1呈低表達(dá)的胃癌耐藥細(xì)胞對化療藥物的敏感性，部分逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥細(xì)胞的多藥耐藥表型。因此，CUTL1可能通過調(diào)節(jié)BMP6而參與胃