MAD2蛋白在胃癌細胞中的表達及其參與多藥耐藥機制的研究.pdf

1、本文研究目的： 1.觀察化療藥對胃癌親本敏感細胞和耐藥細胞的毒性； 2.探討MAD2蛋白在不同胃癌細胞系A(chǔ)GS、SGC7901和阿霉素耐藥細胞SGC7901/ADR中的表達及其意義： 3.探討MAD2選擇性剪切體MAD2β對胃癌細胞生長的調(diào)控作用； 4.探討MAD2在正常胃粘膜組織和胃癌組織中的表達。 研究方法： 一、化療藥對胃癌親本敏感細胞和耐藥細胞的毒性1.通過MTT實驗測定細胞對化療

2、藥物的敏感性；2.利用劃痕法檢測化療藥對腫瘤細胞遷移能力的影響。 二、MAD2蛋白在不同胃癌細胞系和耐藥細胞中的表達及其意義。 1.細胞同步化：細胞同步化是指自然的或經(jīng)人為選擇或誘導(dǎo)選擇造成的細胞周期同步化，本實驗應(yīng)用自然同步化法獲取化療藥物作用后不同時間段的細胞蛋白； 2.MAD2在胃癌耐藥細胞與親本細胞中的差異表達：應(yīng)用Westernblot技術(shù)檢測MAD2在胃癌細胞SGC7901及其耐藥細胞SGC7901/

3、ADR、AGS細胞中的表達差異； 3.MAD2在細胞內(nèi)的分布及表達強弱：用細胞免疫組織化學(xué)和細胞免疫熒光觀察MAD2在胃癌細胞中隨細胞周期改變的變化； 4.核型分析和有絲分裂關(guān)卡功能實驗：用秋水仙素誘導(dǎo)細胞周期停滯于有絲分裂中期，檢測有絲分裂中期胃癌細胞染色體數(shù)目和形狀異常程度，以反映細胞有絲分裂關(guān)卡功能。 三、MAD2β對胃癌細胞生長的調(diào)控作用。 1.生長曲線繪制：把MTT法檢測結(jié)果繪制成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MA

4、D2β高表達及低表達細胞系及其對照細胞的生長曲線； 2.集落形成實驗：用平板集落形成實驗檢測MAD2β對單細胞增殖能力的影響； 3.細胞遷移能力的檢測：用劃痕法檢測MAD2β是否對腫瘤細胞遷移能力有影響。 四、MAD2在臨床胃組織標本中的表達。采用免疫組織化學(xué)法檢測MAD2在正常胃粘膜組織和胃癌組織中的表達，以了解MAD2與胃癌的進展。 研究結(jié)果： 一、化療藥對胃癌親本敏感細胞和耐藥細胞的毒性與S

5、GC7901/ADR細胞相比，SGC7901細胞對化療藥敏感，化療藥作用二者之后SGC7901細胞大多數(shù)死亡；而SGC7901/ADR細胞對化療藥耐受，相當(dāng)數(shù)量細胞爬越痕跡線繼續(xù)生長繁殖。 二、MAD2在胃癌細胞中的表達和意義。 1.MAD2在胃癌親本敏感細胞和耐藥細胞中的表達Westemblot分析發(fā)現(xiàn)MAD2在6株胃癌細胞系中均有表達，而在耐藥細胞中的表達較胃癌親本細胞低；在胃癌細胞SGC7901/ADR中，還檢測出

6、0.53Kb的剪切體；不同種類胃癌細胞對各種化療藥的敏感性各有差異，在化療藥物作用下親本敏感細胞SGC7901、AGS中MAD2蛋白表達量明顯減少，而SGC7901/ADR中MAD2蛋白表達量變化不明顯，且與藥物的作用劑量有關(guān)；MAD2蛋白在細胞內(nèi)的表達有一定時間性。 2.MAD2在細胞內(nèi)的分布及表達強弱MAD2分布以膜核為主，胞漿也有；在間期和有絲分裂前期表達較高，進入中期后表達逐漸降低，直至消失。 3.核型分析和有絲

7、分裂關(guān)卡功能實驗以永生化胃粘膜上皮細胞GES為正常對照胃粘膜細胞模型，GES細胞核型較穩(wěn)定；惡性細胞核型分析，染色體畸變、數(shù)目不穩(wěn)定；處于有絲分裂中期的惡性細胞的累積數(shù)目明顯低于對照細胞，說明惡性細胞的有絲分裂關(guān)卡功能下降。 三、MAD2β對胃癌細胞生長的調(diào)控。 1.MAD2β抑制胃癌細胞的增殖：MAD2β表達增加后，細胞增殖減慢，細胞數(shù)明顯減少；siRNA下調(diào)MAD2β表達后，細胞生長增快。 2.MAD2β抑制

8、胃癌細胞的集落形成能力：MAD2β表達上調(diào)降低SGC7901細胞在普通平板上的集落形成能力；而MAD2β表達下調(diào)使SGC7901/ADR細胞的集落形成能力明顯增強。 3.MAD2β對胃癌細胞遷移能力的影響：上調(diào)MAD2β的表達可以減弱SGC7901細胞的遷移能力。 四、MAD2在臨床胃組織標本中的表達。MAD2在胃癌組織中的表達高于正常胃粘膜組織，但低于胃不典型增生組織。MAD2的表達與胃癌組織的分化程度和人群的地區(qū)分布

9、無明顯差異。 研究結(jié)論： 1.胃癌細胞多藥耐藥性形成過程中MAD2的表達和亞細胞定位都發(fā)生了改變，提示MAD2可能參與了胃癌多藥耐藥的發(fā)生。 2.MAD2在胃癌細胞耐藥性形成過程中的變化可能和細胞核內(nèi)化療藥物的濃度、毒性及作用時間均有關(guān)。 3.MAD2β可以抑制胃癌細胞的生長，減弱單細胞的集落形成能力和細胞遷移能力，提示MAD2β與腫瘤的惡性表型相關(guān)。 4.MAD2在胃癌組織中表達與正常組織中的表