MGr1-Ag-37LRP參與PrPC介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞多藥耐藥.pdf

1、胃癌嚴(yán)重威脅著國(guó)人的生命健康?；暖熓钱?dāng)前晚期胃癌的重要治療手段，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥致使胃癌治療失效是胃癌致死的重要因素。因此，多藥耐藥作為胃癌惡性生物學(xué)行為發(fā)展演進(jìn)和治療過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，是胃癌干預(yù)和治療研究的關(guān)鍵所在，也是本實(shí)驗(yàn)室多年來(lái)致力研究的重要方向之一。
　　MGr1是本實(shí)驗(yàn)室前期研究篩選得到的一株具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的與胃癌耐藥密切相關(guān)的單克隆抗體，其抗原在胃癌耐藥細(xì)胞系SGC7901/VCR中的表達(dá)水平顯著高

2、于其親本細(xì)胞系 SGC7901，后續(xù)研究鑒定出 MGr1識(shí)別的目標(biāo)分子為37LRP。MGr1-Ag/37LRP可能參與了缺氧等多個(gè)胃癌耐藥相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過(guò)調(diào)節(jié)P-gp、MRP、Bcl-2、Bax和FAK、PI3K等分子參與胃癌MDR。PrPC是本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)的與胃癌多藥耐藥密切相關(guān)分子群的重要成員。研究發(fā)現(xiàn)PrPC在胃癌細(xì)胞系和組織中廣泛表達(dá)，并在胃癌耐藥細(xì)胞系中較親本細(xì)胞系表達(dá)顯著升高。PrPC可能同時(shí)參與了胃癌細(xì)胞系SG

3、C7901中P-gp依賴(lài)和P-gp非依賴(lài)的耐藥，經(jīng)典MDR分子P-gp、凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax以及PI3K/Akt是PrPC參與胃癌MDR的可能分子通路。PrPC同時(shí)被研究證實(shí)還參與了增殖、轉(zhuǎn)移等多個(gè)胃癌惡性生物學(xué)表型。
　　然而，PrPC作為一個(gè) GPI錨定分子，是如何將細(xì)胞外信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)從而引起胃癌細(xì)胞的一系列生物學(xué)效應(yīng)的呢？國(guó)外同期研究報(bào)道37LRP通過(guò)介導(dǎo)病理型朊蛋白（PrPSc）在人腸上皮細(xì)胞的內(nèi)吞促進(jìn)瘋牛病

4、的感染。這兩個(gè)蛋白又被我們發(fā)現(xiàn)同時(shí)在缺氧誘導(dǎo)的胃癌MDR中發(fā)揮作用，并經(jīng)由相似的分子信號(hào)通路影響了胃癌的MDR表型。這引起了我們的極大興趣，是否MGr1-Ag/37LRP參與了PrPC相關(guān)的胃癌MDR，他們?cè)谖赴┠退幹杏钟兄鯓拥穆?lián)系？
　　研究目的：
　　1.對(duì)MGr1雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化和鑒定并對(duì)MGr1小鼠腹水進(jìn)行純化和鑒定，檢測(cè)MGr1對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞藥物敏感性和細(xì)胞增殖的影響；2.研究MGr1-Ag/37LRP和Pr

5、PC在胃癌中的表達(dá)相關(guān)性、蛋白表達(dá)共定位及相互作用；3.研究胃癌細(xì)胞中PrPC對(duì)MGr1-Ag/37LRP是否具有調(diào)控作用及 MGr1-Ag/37LRP是否參與PrPC介導(dǎo)的胃癌MDR；4.如果MGr1-Ag/37LRP參與了PrPC介導(dǎo)的胃癌MDR，初步探討其可能的機(jī)制。
　　研究方法：
　　1. MGr1的克隆化、純化鑒定及對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞藥物敏感性和細(xì)胞增殖的影響：有限稀釋法對(duì) MGr1雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化，免疫細(xì)胞化學(xué)

6、檢測(cè) MGr1雜交瘤亞克隆細(xì)胞系分泌單抗的能力；將挑選出的 MGr1雜交瘤亞克隆細(xì)胞系制備小鼠腹水，Western blot檢測(cè)其抗體效價(jià)；利用辛酸-硫酸銨沉淀法、xMagTM ProteinG磁珠親和法和rProteinG親和純化法對(duì)小鼠腹水進(jìn)行純化，Western blot檢測(cè)其抗體活性及效價(jià)；Hoechst染色結(jié)合藥敏實(shí)驗(yàn)，利用ArrayScan? VTI高內(nèi)涵篩選分析儀檢測(cè)MGr1純化抗體對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞系 SGC7901/VCR

7、的5-FU藥物敏感性的影響；利用ArrayScan? VTI高內(nèi)涵篩選分析儀結(jié)合Hoechst染色，檢測(cè)MGr1純化抗體對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞系SGC7901/VCR細(xì)胞增殖的影響。
　　2. MGr1-Ag/37LRP和PrPC在胃癌中的表達(dá)相關(guān)性、表達(dá)共定位及相互作用：Western blot檢測(cè)MGr1-Ag/37LRP和PrPC在胃癌細(xì)胞系SGC7901、SGC7901/VCR、MKN28和AGS中的表達(dá)水平，分析其表達(dá)相關(guān)性；免

8、疫組織化學(xué)染色檢測(cè)MGr1-Ag/37LRP和PrPC在胃癌患者組織標(biāo)本中的表達(dá)水平及相關(guān)性；免疫細(xì)胞熒光染色結(jié)合激光共聚焦檢測(cè)MGr1-Ag/37LRP和PrPC在胃癌細(xì)胞系SGC7901、AGS及胃癌患者組織標(biāo)本中中的表達(dá)共定位；免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MGr1-Ag/37LRP和PrPC在胃癌細(xì)胞系SGC7901/VCR中的相互作用。
　　3. MGr1-Ag/37LRP是否參與PrPC介導(dǎo)的胃癌 MDR：Western blot

9、檢測(cè)MGr1-Ag/37LRP在過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá) PrPC的胃癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系 SGC7901/PrP和SGC7901/PrPi中的蛋白表達(dá)水平；siRNA下調(diào)胃癌耐藥細(xì)胞系SGC7901/VCR和過(guò)表達(dá)PrPC的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系SGC7901/PrP中MGr1-Ag/37LRP的表達(dá)，Western blot檢測(cè)MGr1-Ag/37LRP siRNA的干擾效果；MTT法檢測(cè)MGr1-Ag/37LRP siRNA和MGr1純化抗體對(duì)S

10、GC7901/VCR和SGC7901/PrP細(xì)胞系藥物敏感性的影響。
　　4. MGr1-Ag/37LRP參與PrPC介導(dǎo)胃癌MDR的可能機(jī)制：ADR蓄積潴留實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MGr1-Ag/37LRP siRNA對(duì)SGC7901/VCR和SGC7901/PrP細(xì)胞系A(chǔ)DR泵出率的影響；Hoechst染色觀察MGr1-Ag/37LRP siRNA對(duì)SGC7901/PrP細(xì)胞系經(jīng)VCR誘導(dǎo)后的細(xì)胞凋亡的影響；AnnexinⅤ/PI雙染色結(jié)合流

11、式細(xì)胞儀檢測(cè) MGr1-Ag/37LRP siRNA對(duì)SGC7901/VCR和SGC7901/PrP細(xì)胞系經(jīng)VCR誘導(dǎo)后細(xì)胞凋亡率的影響；Caspase3活性染色結(jié)合 ArrayScan? VTI高內(nèi)涵篩選分析儀檢測(cè) MGr1-Ag/37LRP siRNA對(duì)SGC7901/PrP細(xì)胞系經(jīng)VCR誘導(dǎo)后caspase3活性的影響。Western blot檢測(cè)MGr1-Ag/37LRP siRNA對(duì)SGC7901/PrP細(xì)胞系經(jīng)VCR誘導(dǎo)后A

12、kt/pAkt表達(dá)的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1. MGr1的克隆化、純化鑒定及對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞藥物敏感性和細(xì)胞增殖的影響：經(jīng)過(guò)克隆化和免疫細(xì)胞化學(xué)染色篩選，得到一株能高效分泌 MGr1單克隆抗體的小鼠雜交瘤細(xì)胞亞系MGr1-5；用雜交瘤細(xì)胞亞系MGr1-5制備的小鼠腹水，Western blot可獲得陽(yáng)性目的條帶，且抗體效價(jià)可達(dá)1:2000，xMagTM ProteinG磁珠親和法和rProteinG親和純化法均適用于MG

13、r1小鼠腹水的純化；采用Hoechst染色結(jié)合藥敏實(shí)驗(yàn)，利用ArrayScan? VTI高內(nèi)涵篩選分析儀檢測(cè)結(jié)果提示，終濃度為20μg/ml的MGr1純化抗體可顯著增加胃癌耐藥細(xì)胞系 SGC7901/VCR對(duì)5-FU的敏感性（p＜0.05）；利用ArrayScan? VTI高內(nèi)涵篩選分析儀結(jié)合Hoechst染色檢測(cè)結(jié)果提示，終濃度為20μg/ml的MGr1組和2μg/ml的5-FU組均與陰性對(duì)照組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.05），且這

14、兩組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）；但這兩組與小鼠IgG對(duì)照組間沒(méi)有顯著差異（p＞0.05），小鼠IgG對(duì)照組與陰性對(duì)照組之間也沒(méi)有顯著差異（p＞0.05），因此尚不能認(rèn)為MGr1可以直接影響SGC7901/VCR細(xì)胞的增殖；
　　2. MGr1-Ag/37LRP和PrPC在胃癌中的表達(dá)相關(guān)性、表達(dá)共定位及相互作用：Western blot和灰度分析結(jié)果顯示 MGr1-Ag/37LRP和PrPC在胃癌細(xì)胞系SGC7901/VC

15、R、SGC7901、AGS和MKN28中表達(dá)趨勢(shì)一致，并具有顯著相關(guān)性（p＜0.05）；免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)提示，MGr1-Ag/37LRP和PrPC在同一患者的連續(xù)組織切片中呈現(xiàn)一致的表達(dá)模式，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示所檢測(cè)的50例樣本中，MGr1-Ag/37LRP和PrPC的表達(dá)陽(yáng)性率分別為52％和66%，二者的表達(dá)存在顯著相關(guān)性（p<0.05，r=0.3786）；免疫細(xì)胞熒光染色結(jié)合激光共聚焦檢測(cè)結(jié)果顯示，MGr1-Ag/37LRP和P

16、rPC在胃癌細(xì)胞系中主要表達(dá)在細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，在AGS和SGC7901中均可見(jiàn)MGr1-Ag/37LRP和PrPC存在部分共定位；免疫組織熒光染色結(jié)合激光共聚焦顯微鏡掃描結(jié)果顯示，MGr1-Ag/37LRP和PrPC在胃癌組織的腺體中存在共定位；免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利用Protein A/G Agarose結(jié)合PrPC的兔抗人多抗，可將 SGC7901/VCR細(xì)胞中的 PrPC及 MGr1-Ag/37LRP共沉淀，提示MGr1-Ag

17、/37LRP及PrPC在胃癌細(xì)胞中共同存在于一個(gè)蛋白復(fù)合體，可能存在相互作用。
　　3. MGr1-Ag/37LRP是否參與PrPC介導(dǎo)的胃癌MDR：Western blot檢測(cè)結(jié)果提示，MGr1-Ag/37LRP在過(guò)表達(dá)PrPC的胃癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系SGC7901/PrP中的蛋白表達(dá)水平較轉(zhuǎn)入空載體的對(duì)照細(xì)胞系明顯增高，在抑制 PrPC表達(dá)的胃癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系SGC7901/PrPi中較轉(zhuǎn)入空載體的對(duì)照細(xì)胞系明顯降低，提示PrPC

18、蛋白表達(dá)水平可能影響或調(diào)控 MGr1-Ag/37LRP蛋白的表達(dá)；用 siRNA下調(diào)胃癌細(xì)胞系中MGr1-Ag/37LRP的表達(dá)，Western blot檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染MGr1-Ag/37LRP siRNA后的SGC7901/PrP和SGC7901/VCR細(xì)胞中MGr1-Ag/37LRP的蛋白表達(dá)量較轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照的細(xì)胞中顯著減少（p＜0.05），證明該siRNA可以有效地抑制MGr1-Ag/37LRP的蛋白表達(dá)；藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MGr

19、1-Ag/37LRP siRNA可以顯著增加SGC7901/PrP和SGC7901/VCR細(xì)胞系對(duì)P-gp依賴(lài)的ADR、VCR和VP-16以及P-gp非依賴(lài)的5-FU和CDDP的藥物敏感性（p＜0.05）；MGr1純化抗體也可以顯著增加SGC7901/PrP對(duì)上述化療藥物的敏感性（p＜0.05），提示MGr1-Ag/37LRP可能通過(guò)P-gp相關(guān)和非相關(guān)的分子機(jī)制參與了PrPC介導(dǎo)的胃癌MDR。
　　4. MGr1-Ag/37LR

20、P參與PrPC介導(dǎo)胃癌MDR的可能機(jī)制：ADR蓄積潴留實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MGr1-Ag/37LRP siRNA的SGC7901/VCR和SGC7901/PrP細(xì)胞系較轉(zhuǎn)染 siRNA陰性對(duì)照的細(xì)胞阿霉素泵出能力顯著下降（p＜0.05），提示MGr1-Ag/37LRP可能通過(guò)影響胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的攝取和泵出能力參與PrPC介導(dǎo)的胃癌MDR；Hoechst染色檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)VCR誘導(dǎo)后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MGr1-Ag/37LRP siRNA的

21、SGC7901/PrP細(xì)胞系較轉(zhuǎn)染siRNA陰性對(duì)照的細(xì)胞系凋亡細(xì)胞明顯增多；AnnexinⅤ/PI雙染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果提示，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 MGr1-Ag/37LRP siRNA的 SGC7901/VCR和SGC7901/PrP細(xì)胞系較轉(zhuǎn)染 siRNA陰性對(duì)照的細(xì)胞經(jīng)VCR誘導(dǎo)后細(xì)胞凋亡率顯著升高（p＜0.05），提示 MGr1-Ag/37LRP另一方面可能通過(guò)影響胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的凋亡抵抗參與了PrPC介導(dǎo)的胃癌MDR；Ca

22、spase3活性染色結(jié)合 ArrayScan? VTI高內(nèi)涵篩選分析儀檢測(cè)結(jié)果顯示，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MGr1-Ag/37LRP siRNA的SGC7901/PrP細(xì)胞系較轉(zhuǎn)染siRNA陰性對(duì)照的細(xì)胞經(jīng)VCR誘導(dǎo)后caspase3活性顯著增加，進(jìn)一步證實(shí)抑制MGr1-Ag/37LRP的表達(dá)可以顯著促進(jìn)化療藥物誘導(dǎo)后 SGC7901/PrP發(fā)生細(xì)胞凋亡。Western blot檢測(cè)顯示，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MGr1-Ag/37LRP siRNA的SGC7901

23、/PrP細(xì)胞系較轉(zhuǎn)染siRNA陰性對(duì)照的細(xì)胞經(jīng)VCR誘導(dǎo)后pAkt的表達(dá)水平顯著降低，提示MGr1-Ag/37LRP可能通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路影響了PrPC介導(dǎo)的胃癌MDR。
　　結(jié)論：
　　MGr1-5是一株可以有效分泌MGr1的小鼠雜交瘤細(xì)胞亞系，xMagTM ProteinG磁珠親和法和rProtein G親和純化法均適用于 MGr1小鼠腹水的純化。終濃度為20μg/ml的MGr1純化抗體可顯著增加胃癌耐藥細(xì)胞系

24、SGC7901/VCR對(duì)5-FU的敏感性，尚不能認(rèn)為MGr1可以直接影響SGC7901/VCR細(xì)胞的增殖。MGr1-Ag/37LRP與PrPC在胃癌細(xì)胞系和組織中具有良好的表達(dá)相關(guān)性和表達(dá)共定位，可能存在相互作用關(guān)系。MGr1-Ag/37LRP的蛋白表達(dá)水平受PrPC蛋白表達(dá)的調(diào)控，且參與了PrPC介導(dǎo)的胃癌MDR。MGr1-Ag/37LRP siRNA和MGr1純化抗體（20μg/ml）可部分逆轉(zhuǎn)PrPC介導(dǎo)的胃癌MDR表型。MGr1

25、-Ag/37LRP可能同時(shí)參與了PrPC介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞化療藥物泵出能力的提高和對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抵抗。其分子機(jī)制可能是MGr1-Ag/37LRP通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路參與了PrPC介導(dǎo)的胃癌MDR。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的前期研究結(jié)果，MGr1-Ag/37LRP可能是PrPC介導(dǎo)的胃癌MDR相關(guān)信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)分子，仍需要更多的分子機(jī)制研究和體內(nèi)研究結(jié)果來(lái)證實(shí)我們的發(fā)現(xiàn)。本研究充實(shí)了MGr1-Ag/37LRP作為新的胃癌多藥耐藥干