人假想鎂離子轉(zhuǎn)運蛋白在胃癌細胞多藥耐藥性形成中的作用及機制.pdf

1、該課題擬制備HPT蛋白的抗體檢測SGC7901及SGC7901/ADR細胞中HPT蛋白的表達差異;并采用正反義核酸技術進一步研究HPT在胃癌細胞MDR形成中的作用,初步探討其可能的作用機制,以期為逆轉(zhuǎn)胃癌細胞MDR的研究奠定基礎.【目的】(1)構建HPT原核表達載體誘導表達HPT蛋白,免疫小鼠制備抗血清并檢測其在胃癌耐藥細胞中的表達;(2)構建HPT正、反義核酸真核表達載體,分別轉(zhuǎn)染SGC7901和SGC7901/ADR細胞,研究HPT

2、與胃癌細胞MDR的相關性及其可能的機制.【方法】(1)在克隆成功HPT基因cDNA的基礎上,采用DNA重組技術構建其原核表達載體pRSETB/HPT,酶切鑒定;(2)經(jīng)IPTG誘導在大腸桿菌BL21體內(nèi)表達HPT與6×His的融合蛋白,并以SDS-PAGE和Western blot鑒定;(3)用含融合蛋白的聚丙烯酰胺凝膠顆粒免疫BALB/c小鼠制備抗血清,用Western blot進行鑒定;(4)以所制備的抗血清檢測HPT蛋白在胃癌耐藥

3、細胞系SGC7901/ADR及其敏感親本細胞系SGC7901中的表達;(5)采用分子克隆技術,將HPT基因全長cDNA片段分別按正、反方向克隆入真核表達載體pCDNA3.1(+)的多克隆位點之間,構建HPT正、反義核酸,酶切鑒定;(6)用脂質(zhì)體介導法分別轉(zhuǎn)染HPT正、反義核酸入胃癌藥敏細胞SGC7901及耐藥細胞SGC7901/ADR,經(jīng)G418篩選,Western blot法鑒定獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆;(7)MTT法對轉(zhuǎn)染細胞及對照細胞進行