膜聯(lián)蛋白A11對人胃癌細(xì)胞株AGS順鉑耐藥性影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：胃癌是消化系統(tǒng)腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及死亡率一直居高不下，在我國，胃癌死亡率占我國惡性腫瘤死亡率的第2位。由于早期胃癌很少有明顯的癥狀，因此大部分患者確診時已經(jīng)是胃癌晚期，失去手術(shù)機(jī)會，化療成為胃癌主要治療手段之一。順鉑是各期胃癌化療的一線藥物，但是有效率仍然不超過20％，其中胃癌對順鉑耐藥是胃癌化療失敗的重要原因。隨著胃癌順鉑耐藥機(jī)制的研究深入，一系列耐藥相關(guān)基因相繼被發(fā)現(xiàn)，其中膜聯(lián)蛋白A（AnnexinsA, A

2、NXA）家族在人胃癌細(xì)胞耐藥中發(fā)揮著重要作用。但是膜聯(lián)蛋白A11（Annexin A11, ANXA11）是否與人胃癌細(xì)胞AGS順鉑耐藥性相關(guān)，目前尚未見到相關(guān)報道。因此，本研究以人胃癌細(xì)胞AGS為研究對象，應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)，通過抑制ANXA11基因表達(dá)后，檢測各組人胃癌細(xì)胞AGS對順鉑敏感性，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組較陰性對照組及空白對照組敏感性顯著提高，并對其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行初步探討，為緩解胃癌細(xì)胞對順鉑耐藥性提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　

3、方法：培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞株AGS和人胃癌細(xì)胞株MGC-803，應(yīng)用實(shí)時熒光定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Quantitative real-time reverse transcription, qPCR）、Western blot檢測兩株細(xì)胞ANXA11 mRNA及蛋白水平的表達(dá)。設(shè)計(jì)并且合成針對ANXA11基因的特異性干擾序列siRNA及其陰性對照序列，ANXA11 siRNA及陰性對照序列按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，瞬

4、時轉(zhuǎn)入人胃癌細(xì)胞AGS，轉(zhuǎn)染24、48、72小時后分別以qPCR、Western blot分別檢測ANXA11 mRNA及蛋白水平的表達(dá)情況，檢測抑制效果。實(shí)驗(yàn)分組為：轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染ANXA11-siRNA-2的人胃癌細(xì)胞AGS）、陰性對照組（轉(zhuǎn)染ANXA11-siRNA-NC的人胃癌細(xì)胞AGS）、空白對照組（人胃癌細(xì)胞AGS），以ANXA11-siRNA轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞AGS24、48、72小時后，用CCK-8法檢測各組細(xì)胞在不同濃度順鉑

5、下的細(xì)胞抑制率并計(jì)算各組細(xì)胞IC50及IC20（考慮IC50順鉑對人胃癌細(xì)胞AGS殺傷較大，后續(xù)試驗(yàn)采用IC20順鉑處理細(xì)胞）。實(shí)驗(yàn)分組為：聯(lián)合組（轉(zhuǎn)染ANXA11-siRNA-2的人胃癌細(xì)胞AGS并以其IC20順鉑處理）、陰性對照組（轉(zhuǎn)染ANXA11-siRNA-NC的人胃癌細(xì)胞AGS）、空白對照組（人胃癌細(xì)胞AGS），應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對各實(shí)驗(yàn)組人胃癌細(xì)胞AGS的凋亡率進(jìn)行檢測。轉(zhuǎn)染48小時，分別提取各組人胃癌細(xì)胞AGS總mRNA、蛋白

6、，分別應(yīng)用qPCR、Western blot檢測各組人胃癌細(xì)胞AGS中Bax和Bcl-2 mRNA及蛋白水平表達(dá)的改變。
　　結(jié)果：
　　1.ANXA11 mRNA在人胃癌細(xì)胞AGS中的相對表達(dá)量為：0.086±0.022， ANXA11 mRNA在人胃癌細(xì)胞MGS-803中的相對表達(dá)量為：0.223±0.008。ANXA11蛋白在人胃癌細(xì)胞AGS中的相對表達(dá)量為：1.969±0.105， ANXA11蛋白在人胃癌細(xì)胞MGS

7、-803中的相對表達(dá)量為：0.935±0.078。人胃癌細(xì)胞AGS與人胃癌細(xì)胞MGC-803相比，ANXA11 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著升高（P<0.01）。
　　2.ANXA11-siRNA篩選
　　2.1.以 ANXA11-siRNA-1, ANXA11-siRNA-2, ANXA11-siRNA-3, ANXA11-siRNA-123轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞AGS24、48、72小時后，通過qPCR檢測ANXA11 mRNA表達(dá)

8、情況。結(jié)果顯示，與空白對照組及陰性對照組相比，各組ANXA11-siRNA對ANXA11 mRNA的表達(dá)量均有不同程度的抑制作用（F=20.891, P=0.000）,其中ANXA11 siRNA轉(zhuǎn)染48小時最好，以ANXA11-siRNA-2的抑制效率最高，為82.36%。
　　2.2.分別以80nM、100 nM、120nM、150 nM ANXA11-siRNA-2轉(zhuǎn)染胃癌AGS細(xì)胞24、48、72小時后，以Western

9、blot檢測ANXA11蛋白表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組及空白對照組相比，各組對ANXA11蛋白表達(dá)均具有一定抑制作用（F=51.641, P=0.000），其中ANXA11-siRNA-2轉(zhuǎn)染48小時最好，以100nM ANXA11-siRNA-2抑制效率最高，達(dá)到57.03%。
　　3.ANXA11-siRNA-2轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞AGS48小時后，對順鉑的IC50分別為：轉(zhuǎn)染組為：1.923±0.205μg/ml，陰性對照組

10、為：3.817±0.413μg/ml，空白對照組為4.280±0.216μg/ml；對順鉑的IC20分別為：轉(zhuǎn)染組為：0.105±0.012μg/ml，陰性對照組為：0.289±0.154μg/ml，空白對照組為0.233±0.329μg/ml。轉(zhuǎn)染ANXA11 siRNA后人胃癌細(xì)胞AGS對順鉑的敏感性顯著高于空白對照組及陰性對照組(F=149.000，P=0.000)。
　　4.轉(zhuǎn)染組凋亡率為（16.557±0.979）%，聯(lián)

11、合組凋亡率為（40.416±1.652）%，陰性對照組為（6.560±0.680）%，空白對照組為（5.387±0.620）%。與空白對照組及陰性對照組相比，聯(lián)合組和轉(zhuǎn)染組凋亡率均顯著提高（F=698.733, P=0.000）；聯(lián)合組較轉(zhuǎn)染組凋亡率顯著提高（P=0.000）。
　　5.ANXA11-siRNA-2轉(zhuǎn)染對Bax、Bcl-2基因表達(dá)的影響
　　qPCR檢測 ANXA11-siRNA-2抑制 ANXA11表達(dá)后，

12、 Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)的改變。結(jié)果顯示，將100nM的ANXA11-siRNA-2轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞AGS48小時，與空白對照組及陰性對照組相比，聯(lián)合組及轉(zhuǎn)染組Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著降低(F=41.046, P=0.000)，Bax mRNA表達(dá)顯著升高(F=34.205, P=0.000)；聯(lián)合組較轉(zhuǎn)染組 Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著降低(P=0.003)，Bax mRNA表達(dá)顯著升高（P=0.014)。
　　We

13、stern blot檢測ANXA11-siRNA-2抑制ANXA11表達(dá)后，Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的改變。結(jié)果顯示，將100nM的ANXA11-siRNA-2轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞AGS48小時，與陰性對照組及空白對照組相比，聯(lián)合組及轉(zhuǎn)染組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(F=30.184, P=0.000)， Bax蛋白表達(dá)顯著升高(F=41.424, P=0.000)；聯(lián)合組較轉(zhuǎn)染組 Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低（P=0.002），Bax mR

14、NA表達(dá)顯著升高（P=0.049)。
　　結(jié)論：
　　1.與人胃癌細(xì)胞株MGC-803相比，人胃癌細(xì)胞株AGS中ANXA11 mRNA及蛋白表達(dá)較高，通過抑制ANXA11基因表達(dá)可提高人胃癌細(xì)胞AGS凋亡率。
　　2.通過抑制ANXA11基因表達(dá)，可增強(qiáng)順鉑對人胃癌細(xì)胞AGS抑制作用，從而提高人胃癌細(xì)胞AGS對順鉑敏感性。ANXA11可能是參與人胃癌細(xì)胞AGS順鉑耐藥新的基因。
　　3.ANXA11可能通過上調(diào)抑