非小細胞肺癌細胞及其順鉑耐藥細胞株DNA和組蛋白表觀遺傳差異的研究.pdf

1、目的：探討非小細胞肺癌及其順鉑耐藥細胞株DNA和組蛋白的表觀遺傳學差異。
　　方法：選取野生型非小細胞肺癌細胞株A549和H838細胞株，采用逐漸增加順鉑濃度并大劑量沖擊相結合的方法誘導非小細胞肺癌細胞株的耐藥細胞群，誘導后繼續(xù)在正常培養(yǎng)液中培養(yǎng)21天，分別在誘導后第1天、6天、11天、16天和21天，收細胞提取DNA、RNA和蛋白，行如下檢測：MSP研究DNMT1基因和DNMT3b基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)；染色體免疫共沉淀(Ch

2、IP)研究DNMT1基因、DNMT3b基因、H3K4Me2和H3K9Me2的關系；Infnium研究基因組甲基化狀態(tài)，根據甲基化變化適當調整檢查的時間點；熒光定量PCR(qRT-PCR)研究DNMT1、DNMT3b和MDR1的mRNA表達；流式細胞儀(FCM)檢測細胞周期和凋亡；Western blotting檢測DNMT1、DNMT3b和MDR1蛋白表達，其中DNMT1和DNMT3b的表達包括全細胞、胞漿、胞核內游離蛋白和結合于染色體

3、的蛋白；CCK-8檢測細胞生長活性。
　　結果：⑴兩株非小細胞肺癌細胞株經30周順鉑誘導，最終可于目標順鉑濃度2.0ug/ml的培養(yǎng)液中穩(wěn)定增殖，表明細胞株順鉑耐藥誘導成功。⑵順鉑耐藥細胞株脫離順鉑培養(yǎng)后在不同的時間點收集樣本檢測發(fā)現，隨著去藥物培養(yǎng)時間的增加，Western blotting，qRT-PCR, ChIP, MSP, Infinium，DNMT1、DNMT3b基因甲基化水平降低，使該基因mRNA，蛋白，組蛋白以及整

4、體基因組甲基化水平表達均出現先遞減后遞增的一致趨勢，并且能導致細胞周期阻滯，細胞增殖能力亦可先減弱后增強。
　　結論：①非小細胞肺癌細胞株經誘導順鉑耐藥后，能逆轉DNMT1、DNMT3b甲基化狀態(tài)，進一步說明表觀遺傳可以逆轉的性質，為臨床長期進行表觀遺傳治療提供依據。②非小細胞肺癌順鉑耐藥細胞株DNMT1、DNMT3b基因的mRNA、蛋白表達趨勢和在細胞周期的不同時間點出現周期阻滯與這兩個基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)有著較為密切的聯系