非小細胞肺癌細胞及其順鉑耐藥細胞株DNA和組蛋白表觀遺傳差異的研究.pdf

1、目的：探討非小細胞肺癌及其順鉑耐藥細胞株DNA和組蛋白的表觀遺傳學(xué)差異。
　　方法：選取野生型非小細胞肺癌細胞株A549和H838細胞株，采用逐漸增加順鉑濃度并大劑量沖擊相結(jié)合的方法誘導(dǎo)非小細胞肺癌細胞株的耐藥細胞群，誘導(dǎo)后繼續(xù)在正常培養(yǎng)液中培養(yǎng)21天，分別在誘導(dǎo)后第1天、6天、11天、16天和21天，收細胞提取DNA、RNA和蛋白，行如下檢測：MSP研究DNMT1基因和DNMT3b基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)；染色體免疫共沉淀(Ch

2、IP)研究DNMT1基因、DNMT3b基因、H3K4Me2和H3K9Me2的關(guān)系；Infnium研究基因組甲基化狀態(tài)，根據(jù)甲基化變化適當調(diào)整檢查的時間點；熒光定量PCR(qRT-PCR)研究DNMT1、DNMT3b和MDR1的mRNA表達；流式細胞儀(FCM)檢測細胞周期和凋亡；Western blotting檢測DNMT1、DNMT3b和MDR1蛋白表達，其中DNMT1和DNMT3b的表達包括全細胞、胞漿、胞核內(nèi)游離蛋白和結(jié)合于染色體

3、的蛋白；CCK-8檢測細胞生長活性。
　　結(jié)果：⑴兩株非小細胞肺癌細胞株經(jīng)30周順鉑誘導(dǎo)，最終可于目標順鉑濃度2.0ug/ml的培養(yǎng)液中穩(wěn)定增殖，表明細胞株順鉑耐藥誘導(dǎo)成功。⑵順鉑耐藥細胞株脫離順鉑培養(yǎng)后在不同的時間點收集樣本檢測發(fā)現(xiàn)，隨著去藥物培養(yǎng)時間的增加，Western blotting，qRT-PCR, ChIP, MSP, Infinium，DNMT1、DNMT3b基因甲基化水平降低，使該基因mRNA，蛋白，組蛋白以及整

4、體基因組甲基化水平表達均出現(xiàn)先遞減后遞增的一致趨勢，并且能導(dǎo)致細胞周期阻滯，細胞增殖能力亦可先減弱后增強。
　　結(jié)論：①非小細胞肺癌細胞株經(jīng)誘導(dǎo)順鉑耐藥后，能逆轉(zhuǎn)DNMT1、DNMT3b甲基化狀態(tài)，進一步說明表觀遺傳可以逆轉(zhuǎn)的性質(zhì)，為臨床長期進行表觀遺傳治療提供依據(jù)。②非小細胞肺癌順鉑耐藥細胞株DNMT1、DNMT3b基因的mRNA、蛋白表達趨勢和在細胞周期的不同時間點出現(xiàn)周期阻滯與這兩個基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)有著較為密切的聯(lián)系