WAVE1在兒童急性髓細胞白血病多藥耐藥中的作用及機制研究.pdf

1、白血病是兒童最常見的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，化療是當前主要的治療方法。白血病化療失敗的主要原因之一是多藥耐藥(multidrugresistance，MDR)的發(fā)生，尤其在兒童急性髓細胞白血病(AML)中更為突出。而且多藥耐藥的發(fā)生嚴重限制患兒長期無事件生存率。因此，揭示MDR的發(fā)病機制，尋找新的治療干預靶點，對于防治兒童白血病具有重要意義。WASP家族富含脯氨酸同源蛋白1(WASP—family verprolin homologous p

2、rotein1，WAVEl)為肌動蛋白調(diào)節(jié)蛋白，在肌動蛋白聚合和細胞骨架重排中發(fā)揮重要作用。項目組前期研究中發(fā)現(xiàn)WAVEl是白血病細胞中一新型抗凋亡蛋白，并與白血病K562/A02細胞系的多藥耐藥發(fā)生密切相關(guān)。
　　 本研究首先收集AML患兒的BMMCs，通過實時定量PCR和蛋白印跡方法(Western blotting)對52例AML患兒骨髓單個核細胞(BMMCs)中WAVEl、P-糖蛋白(P—glycoprotein，P-g

3、P)、多藥耐藥相關(guān)蛋白1(Multiple resistance-associated protein-1，MRPl)、肺耐藥蛋白(lung—resistance related protein，LRP)和乳腺癌耐藥蛋白(breast cancerresistance protein，BCRP)的表達情況進行了檢測。研究結(jié)果顯示復發(fā)/難治組AML的WAVEl及耐藥相關(guān)基因表達水平顯著高于緩解組患兒，而且同一患兒初治及復發(fā)時的WAVEl基

4、因表達水平明顯高于緩解期，表明WAVEl表達水平與AML的預后和疾病活動程度相關(guān)。進一步利用白血病HL60，K562及其耐藥細胞系，分析了WAVEl對P-gP、MRPl和BCRP表達的影響。研究發(fā)現(xiàn)WAVE1能夠增加K562細胞系P-gP的表達，HL60細胞系MRP1和BCRP的表達。相反，采用RNA干擾技術(shù)降低K562/A02和HL60/ADR耐藥細胞系巾WAVE1的蛋白表達，能顯著下調(diào)這些細胞系中耐藥相關(guān)基因P-gp，MRP1和BC

5、RP的表達水平。
　　 為進一步探討WAVE1影響P-gp等耐藥相關(guān)蛋白表達的機制，本研究以WAVE1蛋白為誘餌，采用抗WAVE1抗體免疫沉淀白血病細胞中的WAVE1結(jié)合蛋白，然后利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)技術(shù)對含有WAVE1結(jié)合蛋白的復合物進行分離，最后采用電噴霧四極桿飛行時間質(zhì)譜(ESI—Q-TOF)結(jié)合數(shù)據(jù)庫查詢鑒定白血病細胞中WAVE1的結(jié)合蛋白，提示W(wǎng)AVE1與埃茲蛋白(Ezrin)存在結(jié)合。同

6、時通過質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)和鑒定了白血病細胞中43個可能與‘WAVE1具有直接結(jié)合的蛋白質(zhì)，這些蛋白主要包含了腫瘤相關(guān)蛋白、細胞骨架蛋白、受體、代謝相關(guān)酶、免疫相關(guān)蛋白、膜及離子通道蛋白和信號通路蛋白。
　　 為進一步證實WAVE1—Ezrin-P-gp之問的相互作用，本研究通過活細胞免疫熒光技術(shù)證明了WAVE1和Ezrin存在空間位置上的共分布。通過基因轉(zhuǎn)染和干擾技術(shù)，發(fā)現(xiàn)K562細胞轉(zhuǎn)染W(wǎng)AVE1基因后可使Ezrin及P-gp表達

7、升高，同時降低了K562細胞對阿霉素(ADM)的敏感性；而在高表達WAVE1的同時，沉默Ezrin基因的表達，P-gp水平并不能明顯增加，而且K562細胞對.ADM的耐藥性也沒有明顯改變，表明WAVE1對P-gp表達的影響主要是通過Ezrin介導。在降低Ezrin表達的同時，白血病細胞系中WAVE1表達并不能明顯降低，進一步提示Ezrin為WAVE1的下游效應蛋白，而不是WAVE1上游調(diào)控蛋白。因此，WAVE1對白血病細胞耐藥性的影響主

8、要是通過Ezrin來完成的。
　　 最后，本研究通過免疫磁珠分選出白血病細胞系和AML患兒BMMCs中的CD34陽性(CD34+)和CD34陰性(CD34-)細胞，通過Western blotting分析發(fā)現(xiàn)CD34+細胞的WAVE1表達水平明顯高于CD34細胞，提示W(wǎng)AVE1可能參與了造血干細胞的分化成熟與白血病干細胞的惡性克隆。
　　 綜上所述，細胞骨架調(diào)節(jié)蛋白WAVE1參與了兒童.AML發(fā)病及多藥耐藥的形成，WAV