小檗堿在兒童耐藥急性淋巴細胞白血病靶向治療中的作用機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 小檗堿誘導兒童p53基因缺失白血病細胞凋亡的實驗研究
　　目的：腫瘤細胞耐藥多由于p53基因異常所致，小檗堿能夠誘導多種腫瘤細胞發(fā)生細胞周期阻滯及細胞凋亡。本研究主要探討小檗堿對兒童p53基因缺失的急性淋巴細胞白血病EU-4細胞凋亡誘導作用及其作用靶點。
　　方法：選取p53基因缺失的EU-4細胞進行實驗，具體如下：
　?。?）終濃度為0、1、10、50、100μm

2、ol/L小檗堿作用EU-4細胞72h，采用CCK-8檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞凋亡，熒光顯微鏡觀察凋亡細胞，免疫印跡方法（Western Blot）檢測Bcl-2基因家族蛋白（Bax和Bcl-xl）及X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）的表達，比色法檢測Caspase-3的活性變化；
　?。?）終濃度為100μmol/L小檗堿分別作用EU-4細胞0、24、48、72h，Western Blot檢測PARP、Caspase-3及XI

3、AP蛋白表達；
　?。?）終濃度為50μmol/L Z-VAD-FMK預處理EU-4細胞30min，使用流式細胞儀觀察小檗堿誘導EU-4細胞凋亡的變化；
　　（4）終濃度為0、0.1、0.5、1.0μmol/L阿霉素作用EU-4細胞48h，Western Blot檢測鼠雙微粒體2（MDM2）和XIAP蛋白的變化；
　?。?）使用小干擾RNA（siRNA）或小檗堿下調(diào)XIAP蛋白的表達，觀察單純降低XIAP表達或者聯(lián)合阿

4、霉素對于EU-4細胞凋亡的影響。
　　結(jié)果：（1）小檗堿作用EU-4細胞后，細胞凋亡率顯著升高（P<0.05），并呈濃度依賴關(guān)系，凋亡相關(guān)蛋白表達出現(xiàn)相應(yīng)變化；
　?。?）小檗堿誘導EU-4細胞凋亡主要依賴Caspase的活性，并且Caspase-3的活性顯著增強（P<0.05）；
　?。?）小檗堿以濃度和時間依賴的方式下調(diào)XIAP蛋白的表達；
　?。?）阿霉素無明顯誘導EU-4細胞凋亡的作用，MDM2及XIAP

5、蛋白表達亦無明顯變化；
　?。?）單純下調(diào)XIAP蛋白的表達引起EU-4細胞明顯凋亡，與阿霉素共同作用后還能夠增強EU-4細胞對于阿霉素的敏感性（P<0.05）。
　　結(jié)論：小檗堿能夠以不依賴p53的方式誘導白血病EU-4細胞凋亡，XIAP作為小檗堿的作用靶點，參與了EU-4細胞的凋亡。
　　第二部分 小檗堿調(diào)控白血病細胞X連鎖凋亡抑制蛋白表達的機制研究
　　目的：小檗堿能夠以X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）為作用

6、靶點誘導白血病細胞凋亡。本研究主要探討小檗堿調(diào)控兒童急性淋巴細胞白血病EU-4細胞中XIAP蛋白表達的具體分子機制。
　　方法：（1）終濃度為100μmol/L小檗堿分別作用EU-4細胞0、24、48、72h，采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測XIAP mRNA變化；放線菌素D實驗觀察小檗堿對于XIAP mRNA穩(wěn)定性的影響；
　?。?）終濃度為0、1、10、50、100μmol/L小檗堿作用EU-4細胞72h，免疫印跡方法（W

7、estern Blot）檢測細胞中鼠雙微粒體2（MDM2）及磷酸化MDM2蛋白量以及亞細胞定位的變化；終濃度為100μmol/L小檗堿分別作用EU-4細胞0、24、48、72h，PCR檢測MDM2 mRNA變化；
　?。?）使用小干擾RNA（siRNA）下調(diào)EU-4細胞中MDM2蛋白的表達，Western Blot檢測降低MDM2表達對于XIAP蛋白的影響；
　?。?）采用放線菌酮實驗觀察小檗堿對于XIAP蛋白穩(wěn)定性的影響，

8、免疫共沉淀實驗檢測小檗堿對于XIAP蛋白泛素化的影響。
　　結(jié)果：（1）小檗堿不影響XIAP mRNA表達量及其穩(wěn)定性；
　?。?）小檗堿以濃度和時間依賴的方式下調(diào)MDM2蛋白表達，并且該調(diào)控可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，小檗堿能夠降低胞漿中MDM2蛋白水平；
　?。?）siRNA下調(diào)MDM2表達以后引起XIAP蛋白表達的降低；
　?。?）小檗堿增高XIAP蛋白自身的泛素化水平，降低XIAP蛋白的穩(wěn)定性，使其通過泛素-蛋白