地西他濱對(duì)急性髓系白血病多藥耐藥及免疫調(diào)控的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分
　　目的:白血病是全球十大高發(fā)惡性腫瘤之一，在35歲以下惡性腫瘤患者中，死亡率高居首位，其中難治復(fù)發(fā)白血病是治療失敗的主要原因之一，導(dǎo)致難治復(fù)發(fā)白血病的根本原因則是多藥耐藥性(MDR)的產(chǎn)生。多藥耐藥的產(chǎn)生往往導(dǎo)致化療療效減低甚至化療失敗，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性已成為近年研究的焦點(diǎn)之一。目前已有研究表明地西他濱(DAC)可能逆轉(zhuǎn)部分實(shí)體瘤及血液系統(tǒng)惡性疾病的耐藥性，但仍處于探索階段。本研究旨在對(duì)比觀察地西他濱對(duì)慢粒急變白血

2、病細(xì)胞系K562及其多藥耐藥株K562/A02增殖的影響，并進(jìn)行相關(guān)機(jī)制的研究，為地西他濱在逆轉(zhuǎn)耐藥領(lǐng)域的研究提供新的思路。
　　方法:用CCK-8法和ATP法(ATP)檢測(cè)K562和K562/A02細(xì)胞株的IC50，用qPCR法驗(yàn)證K562/A02的多藥耐藥基因MDR-1的表達(dá)水平，從而證明K562/A02為多藥耐藥細(xì)胞性;采用IlluminaHuman HT-12 BeadChip技術(shù)檢測(cè)K562與耐藥株K562/A02的基因

3、表達(dá)差異，并對(duì)差異基因進(jìn)行基因功能、信號(hào)通路和共表達(dá)分析，構(gòu)建基因相互作用網(wǎng)絡(luò)及信號(hào)通路相互作用網(wǎng)絡(luò);通過(guò)PharmMapper Server分析地西他濱可能作用靶點(diǎn)，結(jié)合芯片分析結(jié)果尋找差異基因中的關(guān)鍵基因，并檢測(cè)關(guān)鍵基因在地西他濱處理前后的變化情況，明確地西他濱對(duì)多藥耐藥細(xì)胞株K562/A02增值抑制的作用機(jī)制。結(jié)果:K562/A02細(xì)胞具有多藥耐藥性，其對(duì)地西他濱的敏感性較K562更強(qiáng)。這一現(xiàn)象與地西他濱下調(diào)FAM64A基因表達(dá)有

4、關(guān)，但與基因組甲基化水平和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)表達(dá)水平無(wú)關(guān)，可能涉及的信號(hào)通路包括細(xì)胞周期、HIF-1信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路和VEGF信號(hào)通路等。
　　結(jié)論:地西他濱能夠通過(guò)顯著下調(diào)細(xì)胞增殖相關(guān)基因FAM64A的表達(dá)水平，抑制多藥耐藥細(xì)胞株K562/A02的細(xì)胞增殖。
　　第二部分
　　目的:白血病為全球十大高發(fā)惡性腫瘤之一，我國(guó)發(fā)病率為2.1-6.9/10萬(wàn)，死亡率高，在35歲以下的惡性腫瘤患者中高居首

5、位。腫瘤相關(guān)抗原表達(dá)沉默從而形成免疫逃逸，這與白血病的發(fā)生、復(fù)發(fā)密切相關(guān)。地西他濱(Decitabine，DAC)是DNA去甲基化酶抑制劑，能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，強(qiáng)化機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答，與自身或過(guò)繼性輸注免疫細(xì)胞發(fā)揮協(xié)同作用。我們據(jù)此設(shè)計(jì)臨床試驗(yàn)(NCT01690507)，應(yīng)用地西他濱與CAG方案化療聯(lián)合HLA半相合供者淋巴細(xì)胞輸注(DLI)治療老年急性髓系白血病，緩解率達(dá)到目前治療手段中的較高水平。本研究旨在探索基于地西他濱的化

6、療方案聯(lián)合供者淋巴細(xì)胞輸注是否能夠發(fā)揮協(xié)同作用，并進(jìn)一步探討作用機(jī)制。
　　方法:首先，探索不含地西他濱的供者淋巴細(xì)胞輸注是否有效。在第0天給予Balb/c小鼠（7-8W，♀）腹腔接種白血病細(xì)胞WEHI-3共1×105/只，分為四組PBS組、DLI組、DAC組、DAC+DLI組，后兩組第1-5天予第一周期DAC腹腔注射，DLI紐和DAC+DLI組在第7天和第17天分別予以?xún)纱挝察o脈輸注C57×Balb/c F1(CB6F1)小鼠M

7、HC半相合脾臟單個(gè)核細(xì)胞，模擬臨床供者淋巴細(xì)胞輸注，第19天開(kāi)始第二周期的治療，方法同第一周期，每隔兩天觀察小鼠存活情況，小鼠瀕死狀態(tài)下實(shí)施安樂(lè)死;其次，證實(shí)基于地西他濱的化療方案聯(lián)合DLI能夠延長(zhǎng)生存時(shí)間。我們根據(jù)用藥情況分為三組，分別是PBS組、DAC+Ara-C組和DAC+Ara-C+DLI組，第0天處理方式同前，后兩組均于第1-5天連續(xù)腹腔注射DAC和Ara-C，DAC+Ara-C+DLI組于第7天進(jìn)行小鼠脾臟細(xì)胞輸注，觀察小鼠

8、生存時(shí)間;最后，采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法，對(duì)參與DCAG+DLI方案受試者的外周血嵌合情況進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:DLI組與PBS組小鼠生存時(shí)間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;相對(duì)于PBS組，DAC能夠明顯延長(zhǎng)AML小鼠生存時(shí)間，聯(lián)合DLI發(fā)揮協(xié)同作用，進(jìn)一步延長(zhǎng)AML小鼠生存期。受試者外周血嵌合分析表明，供者淋巴細(xì)胞輸注第3-4天，受試者體內(nèi)檢測(cè)到的供者細(xì)胞數(shù)量最多，后逐漸降低，第20天未檢測(cè)到供者細(xì)胞。
　　結(jié)論:在本研究所采用的小鼠AM