地西他濱與硼替佐米聯(lián)合治療急性T淋巴細(xì)胞白血病的機(jī)制研究.pdf

1、目的:白血病是血液系統(tǒng)的一種惡性疾病，病情險(xiǎn)惡，嚴(yán)重威脅人類的健康。白血病細(xì)胞由于自我更新能力增強(qiáng)，增殖失控，分化障礙，凋亡受阻，侵襲并破壞人類各臟器系統(tǒng)。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，目前對(duì)白血病的認(rèn)識(shí)已更加深入、系統(tǒng)和全面，但仍存在許多亟待解決的問(wèn)題，如:白血病起病的原因、發(fā)病機(jī)制、如何預(yù)防及徹底根治等?；熀驮煅杉?xì)胞移植仍是目前白血病治療的主要方法，隨著多項(xiàng)新技術(shù)的開展，白血病的療效得到了提升。如生物靶向治療:抗CD20、CD33、CD5

2、2的單克隆抗體，針對(duì)BCR/ABL、 PML-RARα融合基因靶向藥物的應(yīng)用，凋亡調(diào)節(jié)因子的靶向治療（針對(duì)bcl-2）等，使白血病患者明顯受益。盡管如此，但成人急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)的治療目前仍缺乏有效的治療手段，且預(yù)后差。實(shí)驗(yàn)室前期工作已證實(shí)硼替佐米可抑制急性T淋巴細(xì)胞白血病的腫瘤性增生，但移植后的致瘤小鼠最終仍死于白血病，考慮存在其它的致瘤機(jī)制，值得進(jìn)一步探討。尋找治療急性T淋巴細(xì)胞白血病的新的作用靶點(diǎn)，具有重大意義。<

3、br>　　方法:CCK-8法檢測(cè)去甲基化藥物地西他濱或聯(lián)合硼替佐米對(duì)Notch1高表達(dá)的急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株MOLT-4的增殖的影響;Annexin-Ⅴ/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡;PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期;二代測(cè)序/轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序法篩選用藥前后兩組間差異基因;RT-PCR法檢測(cè)Pax5、NF-κB(p65)及Notch1下游靶基因Hes1 mRNA的表達(dá)情況;構(gòu)建攜帶Pax5過(guò)表達(dá)基因載體的慢病毒;侵染MOLT-4細(xì)胞;CCK-8法檢

4、測(cè)細(xì)胞增殖情況;RT-PCR法檢測(cè)目的基因Pax5 mRNA的表達(dá)，蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)Notch1通路下游蛋白如Hes1及凋亡蛋白如Caspase3和Caspase9的表達(dá)量。
　　結(jié)果:不同濃度的地西他濱作用于MOLT-4細(xì)胞4天，隨著時(shí)間延長(zhǎng)和劑量的加大，地西他濱對(duì)MOLT-4細(xì)胞株的增殖抑制作用越明顯。Annexin-Ⅴ/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡增多，PI染色檢測(cè)檢測(cè)G0/G1期細(xì)胞比例增多，細(xì)胞被

5、阻滯在G0/G1期。且地西他濱與硼替佐米兩藥共同作用MOLT-4細(xì)胞比單用一種藥物的抑制效果更明顯。地西他濱對(duì)MOLT-4細(xì)胞增殖的作用結(jié)果顯示0.5μmol/L地西他濱作用72小時(shí)后，MOLT-4細(xì)胞的增殖活力為對(duì)照組的30.2±2.2％。以此細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，與未加藥處理的MOLT-4細(xì)胞對(duì)照，篩選兩組間差異表達(dá)基因。篩選結(jié)果顯示Pax5、Sfrp2、Sulf1基因的表達(dá)量較用藥前升高，進(jìn)一步PGPCR驗(yàn)證Pax5mRNA表達(dá)量較用藥

6、前升高更明顯。構(gòu)建攜帶Pax5高表達(dá)載體的慢病毒導(dǎo)入MOLT-4細(xì)胞，細(xì)胞的增殖變緩，增殖活力下降。蛋白免疫印跡法（Western blot）結(jié)果顯示Notch1通路下游蛋白Hes1的表達(dá)量減少，凋亡蛋白Caspase3和Caspase9表達(dá)量增加。
　　結(jié)論:地西他濱聯(lián)合硼替佐米較單藥能更有效抑制MOLT-4細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期。其可能機(jī)制是促進(jìn)了Pax5的高表達(dá)，抑制T細(xì)胞特異性的Notch1信