ATF4轉(zhuǎn)錄活化SIRT1的分子機(jī)制及其在介導(dǎo)胃癌多藥耐藥中的作用.pdf

1、【背景】
　　多藥耐藥(MDR)通常是導(dǎo)致包括胃癌在內(nèi)的腫瘤化療失敗最主要的原因之一。胃癌的MDR機(jī)制在本實(shí)驗(yàn)室和其他地方已進(jìn)行了較廣泛而深入的研究，盡管目前已發(fā)現(xiàn)一些重要的分子和信號(hào)通路，然而仍未能完全闡明MDR，提示其他分子或信號(hào)通路也可能參與了MDR的發(fā)生。
　　哺乳動(dòng)物細(xì)胞在缺氧，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，氨基酸缺乏，以及氧化應(yīng)激等應(yīng)激信號(hào)影響下，真核轉(zhuǎn)錄起始因子2α單位(eIF2α)會(huì)被磷酸化激酶磷酸化，這一磷酸化事件則會(huì)引起迅

2、速的和全面的蛋白生物合成減少，同時(shí)一部分基因會(huì)發(fā)生表達(dá)的上調(diào)。這些上調(diào)的基因可以減輕應(yīng)激所致的細(xì)胞損傷，而其中重要的一個(gè)基因就是ATF4。在目前關(guān)于ATF4的文獻(xiàn)中，盡管一部分研究發(fā)現(xiàn)ATF4在嚴(yán)重或過長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)激的誘導(dǎo)下可發(fā)揮促凋亡作用，大量研究結(jié)果仍提示ATF4是一個(gè)重要的應(yīng)激反應(yīng)基因，其在調(diào)節(jié)細(xì)胞適應(yīng)集合應(yīng)激反應(yīng)(ISR)的多種不利環(huán)境下發(fā)揮著重要的保護(hù)作用。近來，一部分研究報(bào)道ATF4在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，并且能保護(hù)腫瘤細(xì)胞免于

3、多種應(yīng)激以及化療藥物所致的損傷。這些保護(hù)作用潛在的機(jī)制包括誘導(dǎo)自噬，促進(jìn)DNA損傷修復(fù)，以及上調(diào)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽等。然而，關(guān)于ATF4在胃癌MDR中的作用尚未見相關(guān)報(bào)道。
　　【目的】
　　研究ATF4是否在胃癌MDR發(fā)生中發(fā)揮一定的作用以及其可能的分子機(jī)制。
　　【方法】
　　1.ATF4在胃癌MDR中的作用
　　1）用qPCR和Westernblot在胃癌親本細(xì)胞SGC7901及其相應(yīng)的多藥耐藥株SGC7

4、901/ADR和SGC7901/VCR中檢測(cè)ATF4的mRNA和蛋白水平。2）用Addgene公司的PLKO.1-TRC病毒載體構(gòu)建針對(duì)ATF4的特異性以及無關(guān)對(duì)照siRNA慢病毒，分別命名為L(zhǎng)V-siATF4和LV-SCR；使用FUW-teto載體構(gòu)建表達(dá)ATF4的慢病毒，其對(duì)照空載體慢病毒作為對(duì)照，分別命名為L(zhǎng)V-ATF4和LV-Vector。3）通過慢病毒轉(zhuǎn)染相關(guān)胃癌細(xì)胞系，并使用puromycin或zeocin進(jìn)行篩選，建立相應(yīng)

5、的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。4）用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LV-ATF4和LV-Vector穩(wěn)轉(zhuǎn)的SGC7901和AGS細(xì)胞系，以及LV-siATF4和LV-SCR穩(wěn)轉(zhuǎn)的SGC7901/ADR和SGC7901/VCR細(xì)胞系在順鉑(CDDP)作用下的集落形成能力。5）用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LV-ATF4和LV-Vector穩(wěn)轉(zhuǎn)的SGC7901，以及LV-siATF4和LV-SCR穩(wěn)轉(zhuǎn)的SGC7901/ADR細(xì)胞在體外對(duì)不同藥物的敏感性差異。6）用Hoechst3

6、3258染料核染色,DNA碎裂檢測(cè)(DNAfragmentationassay)，以及用Westernblot檢測(cè)剪切形式的caspase-3來檢測(cè)5）中的幾種穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系以及其相應(yīng)的親本細(xì)胞對(duì)CDDP誘導(dǎo)凋亡反應(yīng)的差異。
　　2.ATF4對(duì)應(yīng)激反應(yīng)基因SIRT1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究
　　7）用qPCR和Westernblot在5）中的幾種穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中檢測(cè)SIRT1的mRNA和蛋白水平。8）在5）中的幾種穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系以及其相應(yīng)的親本細(xì)

7、胞中用Westernblot檢測(cè)MDR1,MRP,Bcl-2和Bax的表達(dá)。9）使用生物信息學(xué)軟件(Tfsitescanservice,TESS和Genomatix)分析SIRT1基因的5’端序列的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。10）化學(xué)合成約1.2kb的人SIRT1基因啟動(dòng)子序列片段(-1100至+100bp)并將其克隆入pGL3-Basic質(zhì)粒的XhoI和HindIII酶切位點(diǎn)之間。11）用Luciferase報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)來檢測(cè)ATF4對(duì)SIR

8、T1啟動(dòng)子活性的影響。12）用ChIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ATF4對(duì)SIRT1啟動(dòng)子的直接結(jié)合能力。13）使用定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)突變SIRT1啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒上可能的ATF4結(jié)合位點(diǎn)并構(gòu)建相應(yīng)的點(diǎn)突變質(zhì)粒。14）使用Luciferase報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)潛在的ATF4結(jié)合位點(diǎn)突變后對(duì)ATF4激活SIRT1啟動(dòng)子活性的影響。
　　3.SIRT1在ATF4誘導(dǎo)胃癌MDR發(fā)生中的作用研究。
　　15）對(duì)LV-ATF4穩(wěn)轉(zhuǎn)的SGC7901和AGS細(xì)胞

9、系分別轉(zhuǎn)染SIRT1特異性或無關(guān)對(duì)照siRNA，之后用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在CDDP作用下的集落形成能力。16）對(duì)LV-ATF4穩(wěn)轉(zhuǎn)的SGC7901細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染SIRT1特異性或無關(guān)對(duì)照siRNA，之后用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其在體外對(duì)不同藥物的敏感性差異。17）對(duì)LV-ATF4穩(wěn)轉(zhuǎn)的SGC7901細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染SIRT1特異性或無關(guān)對(duì)照siRNA，用流式細(xì)胞術(shù)，Hoechst33258染料核染色,以及用Westernblot檢測(cè)剪切形式的cas

10、pase-3來檢測(cè)其對(duì)CDDP誘導(dǎo)凋亡反應(yīng)的差異。18）在17）中的細(xì)胞中檢測(cè)MDR1,MRP,Bcl-2和Bax的表達(dá)。19）用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EX-527對(duì)于LV-ATF4和LV-Vector穩(wěn)轉(zhuǎn)的SGC7901的基礎(chǔ)毒性。20）使用不同濃度的EX-527與LV-ATF4和LV-Vector穩(wěn)轉(zhuǎn)的SGC7901細(xì)胞預(yù)孵育24小時(shí)后，使用Westernblot檢測(cè)SIRT1,ATF4,MDR1,MRP,Bcl-2和Bax表達(dá)變化。21）

11、使用不同濃度的EX-527與LV-ATF4穩(wěn)轉(zhuǎn)的SGC7901細(xì)胞預(yù)孵育24小時(shí)后，用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CDDP和5-FU對(duì)以上細(xì)胞的毒性。22）用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EX-527和不同濃度CDDP和5-FU對(duì)LV-ATF4穩(wěn)轉(zhuǎn)的SGC7901細(xì)胞增殖是否具有協(xié)同抑制作用。
　　【結(jié)果】
　　1.ATF4可促進(jìn)胃癌多藥耐藥表型的發(fā)生并且阻斷ATF4表達(dá)可逆轉(zhuǎn)胃癌多藥耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗
　　1）ATF4的mRNA和蛋白水平在

12、多藥耐藥株SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中均明顯高于其親本細(xì)胞SGC7901。2）LV-siATF4和LV-SCR，以及LV-ATF4和LV-Vector等慢病毒載體均得以成功制備。3）成功建立了LV-ATF4和LV-Vector穩(wěn)轉(zhuǎn)的SGC7901和AGS細(xì)胞系，以及LV-siATF4和LV-SCR穩(wěn)轉(zhuǎn)的SGC7901/ADR和SGC7901/VCR細(xì)胞系。4）在SGC7901和AGS細(xì)胞系過表達(dá)ATF4后使得相應(yīng)細(xì)胞

13、在CDDP作用下克隆數(shù)為空載體轉(zhuǎn)染組的近三倍；而在耐藥細(xì)胞株SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中下調(diào)ATF4表達(dá)后則導(dǎo)致CDDP作用下克隆數(shù)較對(duì)照組減少兩到三倍。5）在SGC7901中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ATF4后，阿霉素(ADR)，長(zhǎng)春新堿(VCR)，順鉑(CDDP)和5-氟尿嘧啶(5-FU)的IC50值均較空載體轉(zhuǎn)染組明顯升高。而在耐藥細(xì)胞株SGC7901/ADR中下調(diào)ATF4表達(dá)后，細(xì)胞對(duì)以上化療藥物的敏感性均較對(duì)照組明顯增強(qiáng)。6

14、）在一定濃度的CDDP孵育36小時(shí)后，用Hoechst33258染料核染色和DNAfragmentationassay檢測(cè)在SGC7901-ATF4和SGC7901/ADR-SCR中并未發(fā)現(xiàn)明顯的凋亡改變，而在SGC7901-Vector和SGC7901/ADR-siATF4細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了明顯的細(xì)胞核濃縮破裂和DNALadder形成等細(xì)胞凋亡表現(xiàn)。不僅如此，使用Westernblot在SGC7901-Vector和SGC7901/ADR-

15、siATF4細(xì)胞中較對(duì)照組更早地和更多地發(fā)現(xiàn)了剪切體形式的caspase-3的表達(dá)。
　　2.ATF4可轉(zhuǎn)錄激活應(yīng)激反應(yīng)基因SIRT1的表達(dá)
　　7）在SGC7901細(xì)胞中過表達(dá)ATF4后SIRT1的mRNA和蛋白水平均較對(duì)照組明顯升高；而在SGC7901/ADR中下調(diào)ATF4表達(dá)后SIRT1的mRNA和蛋白水平均較對(duì)照組明顯下降。8）ATF4表達(dá)高的細(xì)胞較相應(yīng)的低表達(dá)ATF4的細(xì)胞中MDR1均相應(yīng)高表達(dá)，且伴有升高的Bcl

16、-2/Bax比率，MRP的表達(dá)無明顯差異。9）使用在線生物信息學(xué)軟件(Tfsitescanservice,TESS和Genomatix)分析SIRT1啟動(dòng)子序列以后，在-950至-600bp之間發(fā)現(xiàn)兩處ATF4的潛在結(jié)合位點(diǎn)。10）成功地合成了約1.2kb的人SIRT1基因啟動(dòng)子序列片段(-1100至+100bp)并將其克隆入pGL3-Basic質(zhì)粒的XhoI和HindIII酶切位點(diǎn)之間。DNA測(cè)序證實(shí)了質(zhì)粒構(gòu)建成功。11）Lucife

17、rase報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果提示ATF4可以顯著激活SIRT1基因啟動(dòng)子活性并且這種效應(yīng)具有劑量依賴性的特點(diǎn)。12）使用ChIP實(shí)驗(yàn)在SGC7901-ATF4細(xì)胞中用ATF4抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)SIRT1基因啟動(dòng)子上的兩處ATF4結(jié)合位點(diǎn)的片段均呈現(xiàn)明顯富集現(xiàn)象。13）針對(duì)1.2kbSIRT1-pGL3-Basic質(zhì)粒上的ATF4潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，成功構(gòu)建了相應(yīng)的點(diǎn)突變報(bào)告基因質(zhì)粒。14）Luciferase報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果

18、提示突變?nèi)我粷撛诮Y(jié)合位點(diǎn)均可降低ATF4對(duì)SIRT1基因啟動(dòng)子活性的激活能力，同時(shí)突變兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)則完全阻斷了ATF4對(duì)SIRT1基因啟動(dòng)子活性的影響。
　　3.SIRT1在介導(dǎo)ATF4誘導(dǎo)的胃癌多藥耐藥中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用
　　15）在SGC7901-ATF4和AGS-ATF4細(xì)胞中用特異性siRNA下調(diào)SIRT1表達(dá)后聯(lián)合使用CDDP可使平板克隆形成數(shù)目較轉(zhuǎn)染非特異siRNA的對(duì)照組下降40％以上。16）MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示

19、用特異性siRNA下調(diào)SIRT1可使SGC7901-ATF4細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性得到一定程度的恢復(fù)，而在轉(zhuǎn)染非特異siRNA的對(duì)照組中未見藥物敏感性的改變。17）在CDDP作用下，流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst33258核染色檢測(cè)均提示用特異性siRNA下調(diào)SIRT1表達(dá)的SGC7901-ATF4細(xì)胞的凋亡率較轉(zhuǎn)染非特異siRNA的對(duì)照組明顯升高。不僅如此，使用Westernblot實(shí)驗(yàn)在前者中早在CDDP作用12h時(shí)便觀察到了剪切體形式

20、的caspase-3的表達(dá)，而在對(duì)照組中即使CDDP處理24h后亦未觀察到明顯的caspase-3的剪切體出現(xiàn)。18）Westernblot實(shí)驗(yàn)在用特異性siRNA下調(diào)SIRT1表達(dá)的SGC7901-ATF4細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)MDR1的表達(dá)較轉(zhuǎn)染非特異siRNA的對(duì)照組明顯減少，而MRP，Bcl-2和Bax的表達(dá)未見明顯改變。19）MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)濃度高至10μM的EX-527不僅沒有抑制LV-ATF4和LV-Vector穩(wěn)轉(zhuǎn)SGC7901細(xì)

21、胞的活性，反而輕度促進(jìn)了兩種細(xì)胞數(shù)量的增長(zhǎng)。20）使用不同濃度的EX-527與LV-ATF4和LV-Vector穩(wěn)轉(zhuǎn)的SGC7901細(xì)胞預(yù)孵育24小時(shí)后，Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示僅MDR1的蛋白水平出現(xiàn)與EX-527濃度負(fù)相關(guān)的變化，而SIRT1，ATF4，MRP，Bcl-2和Bax表達(dá)與EX-527濃度改變無明顯相關(guān)。21）使用不同濃度的EX-527與LV-ATF4穩(wěn)轉(zhuǎn)SGC7901細(xì)胞預(yù)孵育24小時(shí)后，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示E

22、X-527可增強(qiáng)CDDP和5-FU對(duì)以上細(xì)胞的毒性并呈現(xiàn)濃度依賴性的特點(diǎn)。22）10μM的EX-527可有效協(xié)同不同濃度CDDP和5-FU對(duì)LV-ATF4穩(wěn)轉(zhuǎn)SGC7901細(xì)胞增殖的毒性作用。
　　【結(jié)論】
　　1.ATF4介導(dǎo)了胃癌細(xì)胞MDR表型的發(fā)生，將ATF4作為靶點(diǎn)為逆轉(zhuǎn)胃癌MDR提供了一個(gè)新的途徑。
　　2.ATF4通過了上調(diào)MDR1和Bcl-2/Bax比率等多種機(jī)制促進(jìn)了胃癌細(xì)胞MDR表型的發(fā)生。