TRAIL對(duì)耐藥相關(guān)基因SIRT1作用效應(yīng)的研究.pdf

1、食管癌(esophageal carcinoma)是發(fā)生在食管上皮組織的惡性腫瘤,占所有惡性腫瘤的2％,我國是世界上食管癌高發(fā)地區(qū),平均每年病死約15萬人,手術(shù)后化療是治療食管癌的重要方法之一。近些年,由于藥物的不規(guī)范使用、腫瘤細(xì)胞基因的不穩(wěn)定性、表達(dá)異質(zhì)性、高突變率以及個(gè)體對(duì)化療方案的敏感性差異等原因,導(dǎo)致患者預(yù)后很差,腫瘤產(chǎn)生耐藥性是術(shù)后腫瘤病人化療失敗及復(fù)發(fā)的主要原因之一,因此,降低腫瘤細(xì)胞耐藥性成為臨床治療亟待解決的重要問題。<

2、br>　　 沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator type1,SIRT1)是人類的Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs),基因位于10q22.1,長約33 kb,翻譯后的蛋白質(zhì)分子量大小約為60 KD,具有NAD+依賴的去乙?；富钚浴Ｋ贒NA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期控制、抑制細(xì)胞凋亡、抵抗氧化逆境和延長細(xì)胞壽命方面起著重要作用,因此SIRT1被稱為“長壽基因”

3、。研究表明5種臨床腫瘤的活檢標(biāo)本和不同細(xì)胞來源的耐藥細(xì)胞,均發(fā)現(xiàn)SIRT1的高水平表達(dá),能直接誘導(dǎo)多藥耐藥基因的表達(dá)。
　　 腫瘤壞死因子相關(guān)誘導(dǎo)凋亡配體(Tumor necrosis factor(TNF)-relatedapoptosis-inducing ligand,TRAIL)是通過與FasL和TNF有較高的序列同源性被發(fā)現(xiàn)的,又被稱為Apo2L,定位在人類3號(hào)染色體3q26上,全長大約有1769bp,分子量大概為32

4、.5KD,它編碼281個(gè)氨基酸序列。TRAIL因其能夠有效地抑制并殺死腫瘤細(xì)胞但對(duì)正常細(xì)胞的凋亡作用較小而引起人們的普遍關(guān)注。有研究顯示,TRAIL還可與化、放療協(xié)同發(fā)揮作用,從而達(dá)到逆轉(zhuǎn)腫瘤耐受、多要耐藥的目的。但國內(nèi)關(guān)于TRAIL與耐藥基因SIRT1作用關(guān)系的研究很少,尚未見報(bào)道。本課題研究采用構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-TRAIL的方法,用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞來進(jìn)一步研究TRAIL在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)及其產(chǎn)生的凋亡效應(yīng)

5、,并初步探討TRAIL對(duì)腫瘤耐藥相關(guān)基因SIRT1的作用效應(yīng),為降低腫瘤耐藥性研究奠定理論基礎(chǔ)。
　　 目的:構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-TRAIL,檢測其在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)及產(chǎn)生的凋亡作用,并初步探討TRAIL對(duì)腫瘤耐藥相關(guān)基因SIRT1的作用效應(yīng),為逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法:用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切的方法從原核載體pCA13-TRAIL上切下目的基因TRAIL,回收大約8

6、48bp大小片段,并同時(shí)雙酶切真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+),然后用T4連接酶進(jìn)行連接,構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-TRAIL并用雙酶切進(jìn)行鑒定；用脂質(zhì)體2000將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人食管癌細(xì)胞EC9706中,48h以后用RT—PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)方法分別檢測其在食管癌細(xì)胞中mRNA和蛋白水平的表達(dá)；光學(xué)顯微鏡和倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡過程的一般生物學(xué)形態(tài)變化；用流式細(xì)胞技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒24h、48h后對(duì)食管癌細(xì)胞

7、產(chǎn)生的凋亡效應(yīng)；RT—PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)法分別檢測重組質(zhì)粒TRAIL對(duì)耐藥相關(guān)基因SIRT1的mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響,初步探討TRAIL對(duì)腫瘤耐藥相關(guān)基因SIRT1的作用效應(yīng)。
　　 結(jié)果:
　　 1重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-TRAIL的構(gòu)建及鑒定
　　 用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切pCA13-TRAIL質(zhì)粒,回收約848bp大小片段,將此片段與同時(shí)雙酶切后的pcDNA3.1(+)用T4連

8、接酶連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒；經(jīng)雙酶切鑒定后得到的片段大小分別為5400bp左右和800bp左右,說明TRAIL基因成功地克隆到表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中。
　　 2重組質(zhì)粒TRAIL基因在食管癌細(xì)胞中表達(dá)的鑒定
　　 重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞,48h后,提取細(xì)胞RNA,RT—PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-TRAIL組較未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒組表達(dá)量顯著增高,電泳結(jié)果經(jīng)軟件檢測未

9、轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染組灰度值與相應(yīng)內(nèi)參的比值分別是1.05±0.33、1.05±0.33和1.80±0.35,說明轉(zhuǎn)染目的基因組TRAIL基因的mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.05)；轉(zhuǎn)染48h后,用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測顯示TRAIL在細(xì)胞膜、質(zhì)均有表達(dá)且轉(zhuǎn)染目的基因組的棕黃色明顯高于未轉(zhuǎn)染組,經(jīng)軟件檢測得到的灰度值分別為118.23±0.46和78.19±0.41,說明轉(zhuǎn)染后TRAIL基因蛋白水平的表達(dá)顯著增高(P<0.05)。<

10、br>　　 3 TRAIL對(duì)食管癌細(xì)胞的凋亡作用
　　 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒24h未見凋亡曲線,而48h后細(xì)胞周期有凋亡曲線,較未轉(zhuǎn)染組增殖指數(shù)減少明顯(P<0.05),說明轉(zhuǎn)染后48h TRAIL基因的凋亡作用達(dá)高峰。
　　 4重組質(zhì)粒對(duì)腫瘤耐藥相關(guān)基因SIRT1的作用效應(yīng)
　　 重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞,48h后,提取細(xì)胞RNA,RT—PCR顯示轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-TRAIL組

11、較、未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒組表達(dá)量顯著降低,電泳結(jié)果經(jīng)軟件檢測未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染組灰度值與相應(yīng)內(nèi)參的比值分別是1.79±0.35、1.79±0.35和1.06±0.32,說明轉(zhuǎn)染后對(duì)耐藥基因SIRT1的mRNA表達(dá)顯著抑制(P<0.05)；轉(zhuǎn)染48h后,用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測顯示SIRT1在細(xì)胞核、質(zhì)表達(dá)顯著降低幾乎不見棕黃色顆粒,明顯低于未轉(zhuǎn)染組,經(jīng)軟件檢測得到的灰度值分別為78.18±0.42和118.

12、24±0.46,說明TRAIL能顯著抑制耐藥相關(guān)基因SIRT1蛋白水平的表達(dá)(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1本實(shí)驗(yàn)成功地構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-TRAIL,并證實(shí)其能在人食管癌EC9706細(xì)胞中的mRNA和蛋白水平大量表達(dá)TRAIL基因。
　　 2本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TRAIL基因能對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞產(chǎn)生凋亡效應(yīng)。
　　 3本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-T