Sirt1轉(zhuǎn)基因小鼠下肢缺血后血管新生的初步研究.pdf

1、目的：血管新生是由已存在的血管形成新毛細血管的過程，它可以為機體提供更多的血流，但當其發(fā)生調(diào)節(jié)紊亂時可導致多種疾病的病理過程。有研究證實，哺乳動物沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator1, SIRT1）在血管新生中起關鍵調(diào)節(jié)作用。本實驗利用Sirt1轉(zhuǎn)基因(Sirt1-transgenic, Sirt1-Tg)小鼠建立下肢股動脈結(jié)扎-缺血模型，對缺血后組織血管新生進行初步研究。
　　方法：⑴隨

2、機選取6~8周齡大小的Sirt1-Tg小鼠，按雌雄比例為2:1進行交配，繁殖仔鼠，取仔鼠鼠耳組織提取基因組DNA，用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）技術進行基因型鑒定。⑵隨機選取8周齡成年雄性野生型（wild-type, WT）C57BL/6小鼠（對照組）及Sirt1-Tg小鼠（實驗組）各10只，在固定環(huán)境（室溫24℃，濕度相對恒定）下，異氟烷麻醉小鼠后，先用血流測量儀（PeriCam PSI

3、）檢測術前各組小鼠雙下肢血流灌注情況，采用激光散斑對比分析（Laser Speckle Contrast Analysis, LASCA）技術記錄血流圖像，用 PIMSoft（Software Version1.5）軟件計算左右下肢平均血流的比值。然后在顯微鏡視野內(nèi)結(jié)扎并剪斷左下肢股動脈，手術結(jié)束后縫合皮膚，再次觀察術后各組小鼠雙下肢血流狀態(tài)并記錄血流圖像及左右下肢平均血流的比值。⑶小鼠在麻醉狀態(tài)下，分別于術后3天、7天、14天，采用P

4、eriCam PSI對兩組小鼠雙下肢血流灌注變化情況進行檢測，同時記錄血流圖像及左右下肢平均血流的比值。⑷術后14天對兩組小鼠進行血流檢測后，麻醉處死小鼠，分別取兩組小鼠雙下肢腓腸肌，包埋于OCT包埋劑中，并用液氮迅速冷凍后，采用冰凍切片技術進行組織切片，然后切片行組織免疫熒光染色，利用熒光顯微鏡觀察每組小鼠腓腸肌中CD31的陽性熒光強度。⑸取術后14天兩組小鼠腓腸肌組織進行總蛋白提取，用 western blot方法檢測組織中VEGF

5、的表達情況。⑹實驗重復三次，計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：①對Sirt1-Tg小鼠交配產(chǎn)生的子代小鼠進行基因型鑒定，PCR擴增產(chǎn)物長度為233 bp，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在250 bp附近可見清晰的條帶。②用LASCA技術檢測血流結(jié)果顯示，股動脈結(jié)扎術前兩組小鼠雙下肢血流信號分布均勻，WT組小鼠與Sirt1-Tg組小鼠左右下肢平均血流比值分別為0.91±0.

6、07與0.92±0.10（P>0.05）；術后，兩組小鼠左下肢結(jié)扎側(cè)的血流信號均明顯減少，甚至消失，WT組小鼠與Sirt1-Tg組小鼠雙下肢血流比值分別為0.29±0.05與0.31±0.05（P>0.05），術后與術前相比，差異明顯（P<0.01），提示模型建造成功。③用LASCA技術檢測血流結(jié)果顯示，股動脈結(jié)扎術后3天兩組小鼠左下肢結(jié)扎側(cè)均顯示出微弱的血流信號，WT組小鼠與Sirt1-Tg組小鼠雙下肢血流比值分別為0.48±0.05

7、與0.47±0.08（P>0.05），提示血管開始新生；術后7天兩組小鼠左下肢血流均逐漸恢復，WT組小鼠與Sirt1-Tg組小鼠雙下肢血流比值分別為0.68±0.05與0.55±0.04（P>0.05）；術后14天WT組小鼠左下肢血流接近對側(cè)未結(jié)扎肢體，而Sirt1-Tg組小鼠左下肢血流信號明顯弱于WT組同側(cè)肢體，WT組小鼠與Sirt1-Tg組小鼠雙下肢血流比值分別為0.82±0.10與0.66±0.07（P<0.01）。④冰凍切片免疫

8、組織熒光染色結(jié)果顯示，術后14天，與右下肢正常側(cè)相比，兩組小鼠左下肢缺血側(cè)腓腸肌組織中CD31熒光表達量均增加，但Sirt1-Tg組小鼠左下肢腓腸肌組織中的 CD31熒光密度增加量明顯低于WT組小鼠的增加量，WT組小鼠與 Sirt1-Tg組小鼠左右下肢腓腸肌的CD31表達量比值分別為1.99±0.17和1.39±0.04（P<0.05）。⑤Western blot結(jié)果顯示，術后14天，與右下肢正常側(cè)相比，兩組小鼠左下肢缺血側(cè)腓腸肌組織中