PTA1-CD226轉(zhuǎn)基因小鼠胸腺細(xì)胞的發(fā)育研究.pdf

1、本文研究目的：建立四環(huán)素調(diào)控的mPTA1/CD226轉(zhuǎn)基因小鼠，對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠胸腺細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)行研究。 研究方法：①使用pcDNA3-mPTA1和pBI-5載體構(gòu)建用于四環(huán)素調(diào)控轉(zhuǎn)基因小鼠制備的pBI-5-mPTA1載體。②采用顯微注射的方法將pBI-5-mPTA1載體片段導(dǎo)入B6D1F1小鼠受精卵，對(duì)新生小鼠耳成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，用含rtTA的pUHD17.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，選出熒光素酶表達(dá)活性依賴Dox的小鼠。③將陽(yáng)性小鼠與

2、正常C57BL/6小鼠交配，分別使用mPTA1和熒光素酶(luciferase)引物對(duì)子代小鼠的基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)和鑒定，選取雙陽(yáng)性的Ptet-mPTA1轉(zhuǎn)基因小鼠的F1代，將其繼續(xù)與C57BL/6小鼠交配，不斷得到子代小鼠，直至F4代以后。④將陽(yáng)性的Ptet-mPTA1轉(zhuǎn)基因小鼠與攜帶有tTA的EμSR-tTA轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，得到子代小鼠，同時(shí)使用mPTA1和tTA引物對(duì)其基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，選取mPTA1和tTA雙陽(yáng)

3、性的小鼠。⑤使用熒光素酶檢測(cè)試劑盒對(duì)雜交的陽(yáng)性小鼠的不同組織，如胸腺、脾臟、心臟、腎臟等進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)，觀察熒光素酶表達(dá)的組織特異性。⑥將Dox加入小鼠的飲水，檢測(cè)其對(duì)小鼠胸腺細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性的調(diào)控作用。⑦選取7周齡的轉(zhuǎn)基因小鼠及其同窩正常小鼠，對(duì)其胸腺進(jìn)行觀察和細(xì)胞計(jì)數(shù)，并對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠的胸腺細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)分析，觀察mPTA1分子在胸腺細(xì)胞不同亞群上的表達(dá)情況。⑧使用AnnexinV-FITC對(duì)小鼠胸腺細(xì)胞進(jìn)行

4、凋亡檢測(cè)，對(duì)比正常小鼠，觀察其凋亡率的變化。 研究結(jié)果：①經(jīng)測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證，成功構(gòu)建出pBI-5-mPTA1載體。②小鼠耳成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染含rtTA的pUHD17.1質(zhì)粒后，根據(jù)熒光素酶的表達(dá)共得到7只首建(Founder)鼠，其熒光素酶的活性依賴于培養(yǎng)基中的Dox。③將Founder鼠與正常C57BL/6小鼠交配后，共有2只得到了子代F1代小鼠，經(jīng)PCR檢測(cè)，在其基因組DNA中可以擴(kuò)增出731bp(mPTA1)和488bp(luc

5、iferase)兩種條帶；通過(guò)繼續(xù)繁殖，都順利傳到了F4代以后，基因組中插入的外源基因仍然穩(wěn)定存在。④與EμSR-tTA轉(zhuǎn)基因小鼠交配后，順利得到了基因組中mPTA1和tTA雙陽(yáng)性的子代小鼠，PCR檢測(cè)可以擴(kuò)增出731bp(mPTA1)和468bp(tTA)兩種條帶。⑤在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)各組織的熒光素酶活性檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)只有胸腺內(nèi)有其高表達(dá)，其它組織內(nèi)的表達(dá)水平與正常小鼠無(wú)明顯差別，表明轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)外源基因的表達(dá)具有組織特異性。⑥飲水中D

6、ox的加入，可以明顯阻斷熒光素酶的表達(dá)至很低的水平，證明轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)外源性基因的表達(dá)是可以調(diào)控的，且背景表達(dá)水平很低，符合實(shí)驗(yàn)的要求。⑦7周齡轉(zhuǎn)基因小鼠的胸腺與正常同窩小鼠相比，體積明顯增大，胸腺細(xì)胞數(shù)是對(duì)照小鼠的2.9倍(2.88×108vs9.9×107)，其中CD4+CD8+亞群細(xì)胞數(shù)增加最多。⑧小鼠胸腺細(xì)胞經(jīng)過(guò)免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，mPTA1在轉(zhuǎn)基因小鼠的胸腺細(xì)胞上表達(dá)明顯高于正常小鼠，進(jìn)一步對(duì)胸腺細(xì)胞各亞群的檢測(cè)

7、發(fā)現(xiàn)，在CD4-CD8-、CD4-CD8+亞群上mPTA1的表達(dá)水平最高。⑨在胸腺4細(xì)胞的凋亡檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠胸腺細(xì)胞的凋亡率為4％，遠(yuǎn)低于正常小鼠16％的凋亡率，表明mPTA1對(duì)凋亡的影響可能是轉(zhuǎn)基因小鼠胸腺發(fā)育異常的主要原因之一。 胸腺發(fā)育是一個(gè)極其復(fù)雜但高度有序的過(guò)程，許多分子在這個(gè)過(guò)程中發(fā)揮不同的重要作用。已知人PTA1/CD226是T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活化型受體，參與多種T細(xì)胞和NK細(xì)胞介導(dǎo)的功能，與腫瘤和自身免疫

8、性疾病的發(fā)生有密切聯(lián)系。作為小鼠體內(nèi)的同源分子mPTA1/CD226，體外的研究表明，其可能在胸腺發(fā)育的過(guò)程中以及其它方面具有重要作用，但一直缺乏有效的體內(nèi)研究手段。在本研究中，我們首次建立了四環(huán)素調(diào)控的小鼠PTA1/CD226轉(zhuǎn)基因小鼠用于胸腺細(xì)胞的發(fā)育研究，并發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因小鼠中，mPTA1/CD226可以特異性的在胸腺細(xì)胞上高表達(dá)，且受到Dox的嚴(yán)格調(diào)控。尤其重要的是，轉(zhuǎn)基因小鼠的胸腺明顯增大，細(xì)胞數(shù)增多，且凋亡率降低。以上的研究為