轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子ATF4對(duì)破骨細(xì)胞分化的調(diào)節(jié).pdf

1、骨骼是一個(gè)不斷更新的具有多種功能的器官，包括調(diào)節(jié)鈣平衡，支撐軟組織提供造血場(chǎng)所等。這些功能是通過骨組織的不管更新，即重塑而完成的。破骨細(xì)胞是唯一具有骨吸收能力的多核細(xì)胞。破骨細(xì)胞來(lái)源于定向的髓系前體細(xì)胞。多種細(xì)胞及其分泌的因子可以調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化及功能，尤其是骨髓基質(zhì)細(xì)胞及其分泌的M-CSF和RANKL。過度的骨溶解是多種病理性損傷中的一個(gè)重要的臨床問題，如癌癥骨轉(zhuǎn)移，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，骨質(zhì)疏松以及Paget's骨病等。因此臨床上需要有效

2、的能抑制骨過度溶解或促進(jìn)骨生成的治療方法，以預(yù)防或減輕骨質(zhì)疏松的發(fā)生，提高病人的生活質(zhì)量。過去的十年里，在解析破骨細(xì)胞生成方面有許多重要的突破，破骨細(xì)胞的分化過程及功能越來(lái)越清晰。許多因子在這過程中發(fā)揮重要的作用，如M-CSF，RANKL，OPG，PU.1以及MITF等。激活轉(zhuǎn)錄因子4(ATF4)是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，通過定點(diǎn)突變的方法，ATF4最早被發(fā)現(xiàn)對(duì)于eye lens纖維的形成至關(guān)重要。隨后越來(lái)越多的研究證明其在成骨細(xì)胞的分化及

3、骨形成的過程中發(fā)揮著重要的作用。有研究證明ATF4可以通過影響成骨細(xì)胞產(chǎn)生RANKL的量來(lái)間接調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化和骨吸收。但是目前尚未見有關(guān)ATF4可以直接調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化的研究報(bào)道。我們認(rèn)為ATF4可以直接影響破骨細(xì)胞的分化。
　　首先，我們通過蛋白印跡的方法以及免疫組織化學(xué)染色的方法確立了ATF4在破骨細(xì)胞系中的表達(dá)，并且通過磷酸酶處理的方法，發(fā)現(xiàn)了其磷酸化形式的存在。然后我們利用了功能喪失和獲得的方法確立了此因子在破骨細(xì)胞

4、形成中的直接作用。在Atf4-/-小鼠的骨中，Trap陽(yáng)性區(qū)域所占的比例明顯減小，信號(hào)強(qiáng)度也減弱;在體外的分化實(shí)驗(yàn)中，由Atf4-/-BMM細(xì)胞所形成的多核破骨細(xì)胞MNCs（大于等于三個(gè)核）的數(shù)量也顯著減少。而且通過骨片溶解吸收實(shí)驗(yàn)(Pit assay)可知，在體外由Atf4-/-BMM所形成破骨細(xì)胞的骨吸收凹陷數(shù)量也明顯減少，但是骨吸收凹陷數(shù)目與MNCs數(shù)目的比值沒有明顯的變化，說(shuō)明ATF4敲除后，破骨細(xì)胞的骨吸收能力沒有明顯改變。在

5、由破骨細(xì)胞特異的Trap啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下，使ATF4在破骨細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因過表達(dá)時(shí)，轉(zhuǎn)基因小鼠呈現(xiàn)出明顯的骨減少癥;血清CTX的水平大幅度升高;破骨細(xì)胞的形成在體內(nèi)和體外都有顯著增加，并且與破骨細(xì)胞分化相關(guān)的基因的表達(dá)水平，不論是蛋白水平還是mRNA水平都顯著上調(diào)。
　　進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，由Atf4-/-小鼠的骨髓細(xì)胞所形成的GM-CFU的集落數(shù)量也明顯少于野生型對(duì)照組，GM-CFU是具有向破骨細(xì)胞分化能力的最原始的造血前體細(xì)胞。
　

6、　將Atf4-/-BMM細(xì)胞與野生型的成骨細(xì)胞共培養(yǎng)或用高濃度的RANKL來(lái)刺激其分化，都不能彌補(bǔ)其向破骨細(xì)胞分化的缺陷。RANKL的信號(hào)是由其受體RANK來(lái)傳遞的。我們通過免疫組織化學(xué)染色的方法以及免疫印跡方法發(fā)現(xiàn)，在Atf4-/BMM細(xì)胞中，RANK的表達(dá)顯著降低，并且其mRNA水平也不能被M-CSF所上調(diào)。此外RANKL對(duì)多條MAPK信號(hào)通路的誘導(dǎo)激活也受ATF4的調(diào)節(jié)。在缺乏ATF4的狀態(tài)下，RANKL對(duì)于三條MAPK的通路的激

7、活能力明顯下降，而NF-kB途徑、PI3K/Akt途徑卻不受影響。但是，ATF4對(duì)于M-CSF的信號(hào)卻沒有明顯的調(diào)節(jié)作用。
　　到目前為止，NFATc1是破骨細(xì)胞分化的最關(guān)鍵基因。無(wú)論是在體內(nèi)還是在體外，ATF4的缺乏都導(dǎo)致NFATc1的表達(dá)水平明顯下降。用逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，使NFATc1在ATF4WT和KOBMM中過表達(dá)，可以以劑量依賴性的方式使Trap陽(yáng)性的MNCs增多。我們利用腺病毒作為載體，在BMM細(xì)胞中過表達(dá)ATF4，發(fā)

8、現(xiàn)ATF4可以以劑量依賴性的方式上調(diào)NFATc1蛋白的表達(dá)水平。在體外，ATF4可以與NFATc1的啟動(dòng)子結(jié)合并能劑量依賴性的激活NFATcl的啟動(dòng)子，另外，通過ChIP assay的方法可以發(fā)現(xiàn)ATF4可以與NFATc1近啟動(dòng)子端的片段相作用并且該作用可以在RANKL的誘導(dǎo)下增強(qiáng)。
　　在BMM細(xì)胞中，ATF4的蛋白水平受M-CSF以及PI3K/AKT途徑的調(diào)節(jié)。在缺乏M-CSF的情況下，ATF4的蛋白水平以時(shí)間依賴性的方式明顯