一個新克隆的microRNA調節(jié)破骨細胞分化的作用及機制研究.pdf

1、第一部分一個新microRNA的克隆及其在破骨細胞分化過程中作用的研究
　　目的:
　　篩選新的小鼠破骨細胞特異性表達或優(yōu)勢表達的microRNA，研究其在小鼠體內不同組織和細胞的表達譜及在破骨細胞分化過程中的作用。
　　方法:
　　將小鼠原代成骨細胞與骨髓細胞共同培養(yǎng)獲得原代破骨細胞，分離并克隆細胞內所有小RNA，并與已知的小RNA進行比對鑒定了一個新的microRNA，提交miRBase數(shù)據(jù)庫注冊后命名為mi

2、R-9718;應用Northern Blot測定小鼠不同組織及細胞miR-9718的表達情況;用M-CSF聯(lián)合RANKL誘導RAW264.7細胞向破骨細胞分化，用Northern Blot及qRT-PCR測定miR-9718在RAW264.7細胞向破骨細胞分化過程中的表達模式;用pSilencer4.1-CMV載體構建miR-9718表達載體pre-miR-9718，并轉染RAW264.7細胞，建立miR-9718過表達細胞模型，加入R

3、ANKL及M-CSF誘導其向破骨細胞分化，提取細胞總RNA用qRT-PCR法測定破骨細胞特異性標記物TRAP及NFATc1的mRNA表達水平，并行TRAP染色觀察破骨細胞分化成熟情況;用2'甲氧基修飾的反義寡核苷酸anti-miR-9718轉染RAW264.7細胞，構建miR-9718表達抑制模型，qRT-PCR法測定破骨細胞分化過程中TRAP及NFATc1的mRNA表達水平，并行TRAP染色觀察破骨細胞分化成熟情況。
　　結果:

4、
　　(1)在小鼠原代破骨細胞中克隆了一個新的microRNA，提交miRBase數(shù)據(jù)庫注冊后命名為miR-9718;(2)發(fā)現(xiàn)miR-9718選擇性在破骨細胞及骨組織中高表達，而在小鼠其它組織和成骨細胞中幾乎不表達;(3) RANKL及M-CSF誘導RAW264.7細胞向破骨細胞分化過程中，miR-9718的表達逐漸增加;(4)用pSilencer4.1-CMV載體成功構建了MiR-9718表達載體，并轉染RAW264.7細胞，

5、NorthernBlot證實RAW264.7細胞中miR-9718表達升高;(5)與對照相比，pre-miR-9718轉染的RAW264.7細胞經(jīng)RANKL及M-CSF誘導分化后，破骨細胞分化標記物NFATc1和TRAP的mRNA表達水平升高，TRAP陽性多核巨細胞數(shù)目顯著增多;(6)與對照相比，anti-miR-9718轉染的RAW264.7細胞經(jīng)誘導向破骨細胞分化后，NFATc1和TRAPmRNA水平降低，TRAP陽性多核巨細胞明顯

6、減少。
　　結論:
　　在小鼠原代破骨細胞中鑒定了一個新的microRNA(miR-9718);在破骨細胞分化過程中miR-9718表達激活，支持破骨細胞的分化。
　　第二部分 miR-9718調控破骨細胞分化的作用機制研究
　　目的:
　　預測并驗證miR-9718在破骨細胞分化中作用的靶基因，研究miR-9718調控RAW264.7細胞向破骨細胞分化的作用機制。
　　方法:
　　利用Rna2

7、2軟件預測miR-9718在破骨細胞分化中作用的靶基因，篩選出PIAS3為其作用的可能靶基因;將包含預測的miR-9718結合位點的PIAS3 CDS片段克隆到pGL3載體中構建野生型PIAS3熒光素酶報告基因(WT-pGL3-PIAS3)，并用定點誘變試劑盒在miR-9718結合位點引入點突變，構建突變型PIAS3熒光素酶報告基因(MUT-pGL3-PIAS3)。將構建兩種載體分別與pre-miR-9718或miR-C交叉轉染RAW2

8、64.7細胞，檢測熒光素酶活性。Pre-miR-9718單獨轉染RAW264.7細胞，qRT-PCR和Westem Blot分別測定PIAS3 mRNA和蛋白水平變化。PCR擴增小鼠PIAS3 CDS全長片段，另用定點誘變試劑盒在擴增片段的miR-9718結合位點引入點突變（不導致編碼氨基酸的改變），與pCDNA3.1載體結合分別構建野生型和突變型PIAS3表達載體。將構建的兩種載體分別與pre-miR-9718或miR-C交叉轉染RA

9、W264.7細胞，用RANKL和M-CSF誘導其向破骨細胞分化后，qRT-PCR和Western Blot分別檢測TRAP、NFATc1mRNA水平和PIAS3蛋白水平。Pre-miR-9718和anti-miR-9718分別轉染RAW264.7細胞，RANKL和M-CSF誘導其向破骨細胞分化，qRT-PCR檢測PIAS3 mRNA水平及Westem Blot檢測NFATc1、MITF、c-FOS、NF-κB和PIAS3蛋白表達水平。<

10、br>　　結果:
　　(1)Rna22預測PIAS3可能為miR-9718在破骨細胞分化中作用的靶基因;(2)構建了野生型和突變型PIAS3熒光素酶報告基因，與轉染miR-C的對照組相比，pre-miR-9718與WT-pGL3-PIAS3共轉染組其熒光素酶活性受到抑制，而pre-miR-9718與MUT-pGL3-PIAS3共轉染組熒光素酶活性無變化;(3)與轉染miR-C的對照組相比，在RAW264.7細胞中單獨轉染pre-m

11、iR-9718抑制了PIAS3蛋白表達水平，而對PIAS3 mRNA水平無明顯影響;(4) pre-miR-9718轉染RAW264.7細胞并誘導向破骨細胞分化后，NFATc1和TRAP mRNA水平顯著升高，pre-miR-9718與WT-PIAS3-CDS表達載體共轉染也能使NFATc1和TRAP mRNA水平升高，而pre-miR-9718與MUT-PIAS3-CDS表達載體共轉染不能增加NFATc1和TRAP mRNA水平;(5

12、) pre-miR-9718轉染RAW264.7細胞并誘導向破骨細胞分化后，PIAS3 mRNA水平無改變，而PIAS3蛋白表達減少，同時調節(jié)破骨細胞分化的重要轉錄因子NFATc1、MITF、c-FOS和NF-κB表達上調;而anti-miR-9718轉染RAW264.7細胞并誘導向破骨細胞分化后，PIAS3蛋白表達增加，NFATc1、MITF、c-FOS和NF-κB表達下調。
　　結論:miR-9718在轉錄后水平抑制PIAS3