流體剪切力作用下破骨細(xì)胞的鈣響應(yīng)特征及機(jī)制.pdf

1、目的：骨組織是結(jié)構(gòu)可動(dòng)態(tài)變化的器官，力學(xué)因素在維持其正常代謝活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。骨組織內(nèi)部的多孔間隙內(nèi)充滿間質(zhì)液，血管壓力和機(jī)械負(fù)荷作用下會(huì)使間質(zhì)液產(chǎn)生流體運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而在骨內(nèi)膜表面產(chǎn)生不同程度的流體剪切力，骨表面的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞以及骨基質(zhì)內(nèi)的骨細(xì)胞在流體剪切力作用下其生物學(xué)性質(zhì)都會(huì)發(fā)生明顯變化。
　　 人體正常的骨代謝主要包括成骨細(xì)胞分泌骨基質(zhì)和破骨細(xì)胞吸收陳舊骨基質(zhì)，其中破骨細(xì)胞是目前已知唯一具有骨基質(zhì)吸收功能的細(xì)胞。許多研

2、究表明破骨細(xì)胞的形成及其破骨功能和鈣離子信號(hào)密切相關(guān)。鈣信號(hào)涉及到細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞遷移、分化及骨基質(zhì)吸收等諸多生物學(xué)過(guò)程，但目前關(guān)于力學(xué)因素對(duì)破骨細(xì)胞的胞內(nèi)鈣離子濃度振蕩及細(xì)胞功能的影響的研究仍較為缺乏，而這一過(guò)程可能對(duì)破骨細(xì)胞的形成和分化具有重要的生理意義。因此本研究主要關(guān)注以下兩個(gè)問(wèn)題：在體外培養(yǎng)條件下，流體剪切力能否誘發(fā)破骨細(xì)胞發(fā)生鈣響應(yīng)？如果有鈣響應(yīng)的發(fā)生，那么是否會(huì)對(duì)破骨細(xì)胞功能產(chǎn)生影響？解決這兩個(gè)問(wèn)題可為臨床上調(diào)控力學(xué)因

3、素對(duì)進(jìn)而影響骨代謝提供科學(xué)依據(jù)和合理指導(dǎo)。
　　 方法：1、破骨細(xì)胞的培養(yǎng)。本研究中采用了三種破骨細(xì)胞培養(yǎng)方法，包括使用M-CSF(Macrophagecolony-stimulatingfactor)和RANKL(ReceptorActivatorofNuclearFactor-BLigand)誘導(dǎo)原代造血干細(xì)胞形成破骨細(xì)胞、使用M-CSF和RANKL促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞形成破骨細(xì)胞、使用MC3T3-E1細(xì)胞上清誘導(dǎo)RAW

4、264.7細(xì)胞形成破骨細(xì)胞。在不同誘導(dǎo)時(shí)間（0天、4天和8天）對(duì)破骨細(xì)胞的相關(guān)特性，例如如凋亡、細(xì)胞核數(shù)目與面積關(guān)系等，進(jìn)行了分析探討。
　　 2、流體剪切力誘發(fā)破骨細(xì)胞的鈣響應(yīng)特征及分析。使用Fluo-4AM對(duì)破骨細(xì)胞內(nèi)鈣離子進(jìn)行染色，然后將細(xì)胞玻片放置于流動(dòng)腔裝置內(nèi)，使用流動(dòng)腔加載系統(tǒng)對(duì)破骨細(xì)胞施加1或10dyne/cm2大小流體剪切力作用10分鐘，并使用熒光顯微鏡記錄攝像，然后使用相關(guān)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　

5、 3、流體剪切力誘發(fā)破骨細(xì)胞鈣響應(yīng)的機(jī)制研究。在體外培養(yǎng)條件下，在破骨細(xì)胞染色結(jié)束后，分別加入不同阻斷劑，包括阻斷細(xì)胞表面機(jī)械敏感鈣離子通道MSCC(MechanosensitiveCalciumChannel)、抑制細(xì)胞內(nèi)磷酸酯酶C(PLC)活性、阻斷細(xì)胞表面電壓敏感通道L-VSCC(L-typevoltage-sensitivecalciumchannel)、消耗盡細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子、阻斷細(xì)胞表面的ATP受體、阻斷細(xì)胞的間隙連接、去

6、除細(xì)胞外鈣離子等7種條件后，觀察流體剪切力作用時(shí)破骨細(xì)胞鈣離子濃度變化情況，并與正常未加阻斷劑組進(jìn)行比較分析來(lái)判斷鈣響應(yīng)的機(jī)制。
　　 4、流體剪切力作用后破骨細(xì)胞功能產(chǎn)物的變化情況。使用Real-TimePCR技術(shù)檢測(cè)c-Fos基因在不同狀態(tài)細(xì)胞中的表達(dá)情況。使用WestemBlot技術(shù)檢測(cè)兩種與破骨細(xì)胞功能密切相關(guān)的蛋白（TRAP和NFATCl）在有、無(wú)流體剪切力刺激條件下的表達(dá)變化情況，其中NFATc1蛋白與破骨細(xì)胞鈣信號(hào)

7、變化密切相關(guān)。
　　 結(jié)果：1、MC3T3-E1細(xì)胞上清中可檢測(cè)到可溶型RANKL的表達(dá)，此上清可誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞形成破骨細(xì)胞，且破骨細(xì)胞核數(shù)目與面積存在相關(guān)性，因而可根據(jù)細(xì)胞面積判斷其核數(shù)目。2、流體剪切力可誘發(fā)破骨細(xì)胞鈣響應(yīng)的發(fā)生，這一響應(yīng)的強(qiáng)度和形式與流體剪切力的大小、細(xì)胞分化程度和細(xì)胞核數(shù)目有相關(guān)性。3、阻斷破骨細(xì)胞的MSCC、抑制細(xì)胞內(nèi)磷酸酯酶C活性或耗盡內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子后，流體剪切力所誘發(fā)的破骨細(xì)胞的鈣振蕩幾乎

8、完全消失；在去除掉細(xì)胞外鈣離子及阻斷細(xì)胞表面ATP受體條件下，部分細(xì)胞也會(huì)出現(xiàn)鈣響應(yīng)，但一般只出現(xiàn)一個(gè)響應(yīng)峰，無(wú)鈣振蕩的出現(xiàn)；阻斷細(xì)胞的間隙連接和電壓敏感通道后，流體剪切力所誘發(fā)的破骨細(xì)胞鈣振蕩強(qiáng)度和形式與正常組相比無(wú)明顯差別。4、與靜止?fàn)顟B(tài)下破骨細(xì)胞相比，經(jīng)過(guò)流體剪切力刺激的破骨細(xì)胞其內(nèi)c-Fos基因和鈣振蕩相關(guān)蛋白NFATc1表達(dá)明顯升高，但TRAP蛋白的表達(dá)沒(méi)有變化。
　　 結(jié)論：1、MC3T3-E1細(xì)胞的上清培養(yǎng)液可以促

9、進(jìn)RAW264.7細(xì)胞融合形成TRAP陽(yáng)性、多核的破骨細(xì)胞。2、流體剪切力可誘發(fā)破骨細(xì)胞發(fā)生鈣振蕩，主要是通過(guò)激活細(xì)胞表面的機(jī)械敏感鈣離子通道，進(jìn)而活化細(xì)胞內(nèi)的PLC酶，使IP3產(chǎn)生增加，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子釋放形成第一個(gè)鈣響應(yīng)峰，胞外鈣離子內(nèi)流和ATP胞外擴(kuò)散是形成隨后的鈣響應(yīng)峰的必要條件；這種鈣振蕩會(huì)促進(jìn)下游功能蛋白NFATc1的表達(dá)增加，使破骨細(xì)胞功能增強(qiáng)。3、與RANKL等因子類似，流體剪切力可作為一獨(dú)立因素誘發(fā)破骨細(xì)胞鈣響應(yīng)的發(fā)