流體剪應(yīng)力作用下成骨細(xì)胞的響應(yīng)及其OPG、ODF表達(dá)的研究.pdf

1、本研究以Wistar大鼠顱骨成骨細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)流動(dòng)腔裝置施以流體剪應(yīng)力，從細(xì)胞的增殖、分化、礦化和形變研究成骨細(xì)胞對(duì)流體剪應(yīng)力的響應(yīng)，從骨保護(hù)因子(OPG)，破骨細(xì)胞分化因子(ODF)的基因表達(dá)研究力學(xué)刺激對(duì)骨吸收和骨形成平衡的調(diào)控，最后嘗試成骨細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞形成的誘導(dǎo)作用，進(jìn)一步考察了力學(xué)刺激影響骨代謝平衡的可能途徑。 主要內(nèi)容和結(jié)果如下： 設(shè)計(jì)加工了對(duì)單層細(xì)胞施以流體剪應(yīng)力的流動(dòng)腔裝置。該裝置能夠提供充分發(fā)散的

2、層流態(tài)流體，通過(guò)流量控制調(diào)節(jié)剪應(yīng)力的大小。整套裝置組裝簡(jiǎn)便，受試細(xì)胞量大(1×105個(gè))，所需灌流液可控制在10ml以內(nèi)，能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行有效的剪應(yīng)力刺激，研究表明能滿足對(duì)各項(xiàng)生化指標(biāo)的檢測(cè)。 運(yùn)用組織塊法培養(yǎng)了大鼠乳鼠顱骨成骨細(xì)胞，并利用差異貼壁法對(duì)其進(jìn)行有效純化。通過(guò)形態(tài)觀察、堿性磷酸酶(ALP)活性檢測(cè)、Von Kossa染色鑒定表明具有成骨細(xì)胞的典型生物學(xué)行為。細(xì)胞經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)至第三代用于后續(xù)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。 對(duì)成骨細(xì)胞

3、施加5、10、20、30 dynes/cm2四個(gè)水平的流體剪應(yīng)力，每個(gè)水平的力分別作用3，6，12，24，36h。加載結(jié)束，受試細(xì)胞做流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，計(jì)算增殖指數(shù)(PI)衡量細(xì)胞增殖能力的變化。細(xì)胞形態(tài)變化通過(guò)顯微鏡形態(tài)觀察和FITC－鬼筆環(huán)肽(FITC-phalloidin)細(xì)胞骨架熒光染色來(lái)觀察。結(jié)果顯示，5，10 dynes/cm2的剪應(yīng)力具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，作用12h細(xì)胞的增殖指數(shù)分別提高了20.2％和45.7％，并

4、且細(xì)胞形態(tài)沿流體流動(dòng)的方向被拉長(zhǎng)，細(xì)胞骨架熒光染色顯示，骨架發(fā)生重排。本實(shí)驗(yàn)中20，30 dynes/cm2的剪應(yīng)力抑制了細(xì)胞的增殖，作用12h，分別降低了72.6％和76.3％。 對(duì)成骨細(xì)胞施加5、10、20、30 dynes/cm2四個(gè)水平的流體剪應(yīng)力，每個(gè)水平的力分別作用3，6，12，24，36h。檢測(cè)成骨細(xì)胞ALP活性和胞外鈣分泌的變化。結(jié)果顯示，剪應(yīng)力作用下ALP的活性從高到低依次是10>20>5>0>30 dynes

5、/cm2，同時(shí)10，20 dynes/cm2在提高ALP活性的同時(shí)，還使ALP活性高峰期相對(duì)于對(duì)照組提前3h。剪應(yīng)力作用下鈣分泌從高到低依次是10>5>20>0>30 dynes/cm2，鈣分泌的時(shí)間分布未受影響，只是分泌量受到調(diào)節(jié)。由此認(rèn)為，適當(dāng)?shù)募魬?yīng)力(如5~20 dynes/cm2)作用能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化成熟，以及礦化基質(zhì)的形成。 對(duì)成骨細(xì)胞施以5、10、15 dynes/cm2單一水平的流體剪應(yīng)力作用24h，以及5、

6、10、15 dynes/cm2梯度增加和15、10、5 dynes/cm2梯度減少的剪應(yīng)力，梯度時(shí)間間隔為8小時(shí)，總作用時(shí)間作用為24h，采用RT-PCR檢測(cè)成骨細(xì)胞OPG、ODF mRNA的表達(dá)狀況。結(jié)果顯示，OPG和ODF mRNA的表達(dá)均能受到剪應(yīng)力作用的影響。與靜態(tài)相比，10 dynes/cm2剪應(yīng)力作用能促進(jìn)OPG mRNA的表達(dá)，抑制了靜態(tài)下表達(dá)逐步降低的趨勢(shì)，同時(shí)顯著抑制了ODF mRNA的表達(dá)，并且抑制作用隨作用時(shí)間的延

7、長(zhǎng)逐步加強(qiáng)。比較相同時(shí)間下(24h)不同水平的剪應(yīng)力作用，以及單一加載和梯度加載的效果發(fā)現(xiàn)，10、15 dynes/cm2作用效果最為明顯，5 dynes/cm2次之。梯度增加的加載方式與10、15 dynes/cm2單一加載方式?jīng)]有顯著差異，梯度減少的加載方式與5 dynes/cm2單一加載也沒有顯著差異，因此認(rèn)為梯度加載的過(guò)程中后一水平的剪應(yīng)力作用掩蓋了前一水平的剪應(yīng)力作用效果，也可以認(rèn)為剪應(yīng)力的作用提高了成骨細(xì)胞對(duì)剪應(yīng)力響應(yīng)的速度

8、，即同一水平的剪應(yīng)力在梯度加載下加載8h的效果與單一加載24h的效果相當(dāng)?？傊魬?yīng)力作用使得OPG/ODF mRNA的平衡向著OPG占優(yōu)的方向變化，這種變化意味著骨吸收會(huì)受到抑制。 以骨髓單核細(xì)胞作為破骨細(xì)胞前體細(xì)胞，嘗試剪應(yīng)力作用下成骨細(xì)胞誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成。結(jié)果顯示，以成骨細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)骨髓單核細(xì)胞能明顯提高細(xì)胞的存活率，改善生長(zhǎng)狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)中形成的多核細(xì)胞的數(shù)量反映，剪應(yīng)力作用下的成骨細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞融合的效果不如靜態(tài)培養(yǎng)下的